Lek. Krzysztof Ossoliński
Metabolomiczna analiza tkanki, surowicy i moczu w
poszukiwaniu potencjalnych biomarkerów raka
pęcherza moczowego
Opracowanie jest rozprawą na stopień naukowy doktora nauk medycznych w
dyscyplinie nauki medyczne na podstawie cyklu 5 publikacji.
Promotor: dr hab. n. med. Paweł Wiechno
Warszawa 2023
Spis treści
Wykaz skrótów 5
Wykaz publikacji stanowiących podstawę postępowania w sprawie o nadanie stopnia
naukowego doktora nauk medycznych 7
Aktywność naukowa 8
Dorobek publikacyjny 10
Rozdział 1: Wprowadzenie 13
1.1 Rak pęcherza moczowego: epidemiologia, czynniki ryzyka, histopatologia i aktualne
metody diagnostyczne 13
1.1.1 Epidemiologia raka pęcherza moczowego 13
1.1.2 Czynniki ryzyka rozwoju raka pęcherza moczowego 13
1.1.3 Histopatologia nowotworów pęcherza moczowego 14
1.1.4 Grading i staging raka pęcherza moczowego 16
1.1.5 Diagnostyka raka pęcherza moczowego 19
1.1.6 Markery nowotworowe raka pęcherza moczowego 20
1.1.6.1 Wstęp 20
1.1.6.2 Cytologia moczu 21
1.2 Metabolomika: zastosowanie w badaniach nad nowotworami 24
1.3 Metody analizy chemicznej stosowane w metabolomice 24
1.3.1 Spektrometria mas (MS) 27
1.3.1.1 Obrazowanie MS (MSI) 27
1.3.2 Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) 29
1.3.3 Zalety oraz wady poszczególnych metod analizy chemicznej 29
1.3.4 Analiza danych 31
1.3.5 Analiza statystyczna w badaniach metabolomicznych 32
Rozdział 2: Założenia i cel pracy 37
Rozdział 3: Materiały i metody 39
3.1 Protokół badania, przygotowanie materiału 39
Rozdział 4: Wyniki i dyskusja 40
4.1 Analiza metabolomiczna tkanki 40
4.2 Analiza metabolomiczna surowicy 41
4.3 Analiza metabolomiczna moczu 46
Podsumowanie i wnioski 51
Streszczenie 54
Streszczenie po angielsku 56
Piśmiennictwo 58
Załączniki 61
2
Wykaz skrótów
Skrót
ENG
PL
1H NMR
Proton Nuclear Magnetic Resonance
Spektroskopia protonowa magnetycznego
rezonansu jądrowego
AUC
Area Under Curve
Pole pod krzywą
BC
Bladder Cancer
Rak pęcherza moczowego
CIS
Carcinoma in situ
Rak in situ
ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Test immunoenzymatyczny
FC
Fold Change
Zmiana wielkości (w kontekście biologicznym)
FDA
Food and Drug Administration
Agencja Żywności i Leków
FISH
Fluorescent In Situ Hybridization
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ
GC
Gas Chromatography
Chromatografia gazowa
HG
High Grade
Wysoki stopień złośliwości histopatologicznej
HILIC
Hydrophilic-Interaction Liquid Chromatography
Chromatografia cieczowa oddziaływań
hydrofilowych
HPLC
High-Performance Liquid Chromatography
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
HRMS
High Resolution Mass Spectrometry
Spektrometria mas wysokiej rozdzielczości
hTERT
Human Telomerase Reverse Transcriptase
Ludzka odwrotna transkryptaza telomerazy
KEGG
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
Encyklopedia genów i genomów Kioto
LASIS
Laser Ablation Synthesis in Solution
Laserowa ablacja z syntezą w roztworze
LC
Liquid Chromatography
Chromatografia cieczowa
LG
Low Grade
Niski stopień złośliwości histopatologicznej
MIBC
Muscle Invasive Bladder Cancer
Rak pęcherza moczowego naciekający
mięśniówkę
MS
Mass Spectrometry
Spektrometria mas
m/z
mass-to-charge ratio
Stosunek masy do ładunku
MSP
Methylation Specific PCR
Metylo-specyficzny PCR
NMIBC
Non-Muscle Invasive Bladder Cancer
Rak pęcherza moczowego nie naciekający
mięśniówkę
NC
Normal Control
Próbka kontrolna (tkanka, mocz lub surowica)
OPLS-DA
Orthogonal Partial Least Squares Discriminant
Analysis
Ortogonalna analiza dyskryminacyjna
częściowych najmniejszych kwadratów
PCA
Principal Component Analysis
Analiza głównych składowych
PCR
Polymerase Chain Reaction
Reakcja łańcuchowa polimerazy
PLS-DA
Partial Least Squares Discriminant Analysis
Częściowa analiza dyskryminacyjna metodą
najmniejszych kwadratów
ROC
Curve
Receiver Operating Characteristic Curve
Krzywa charakterystyki operacyjnej odbiornika
3
RP-HPLC
Reversed Phase High-Performance Liquid
Chromatography
Wysokosprawna chromatografia cieczowa w
odwróconym układzie faz
RPLC
Reversed Phase Liquid Chromatography
Chromatografia cieczowa odwróconej fazy
RT-PCR
Real-Time Polymerase Chain Reaction
Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie
rzeczywistym
SCC
Squamous Cell Carcinoma
Rak płaskonabłonkowy
SMPDB
The Small Molecule Pathway Database
Baza danych ścieżek małych cząsteczek
TOF
Time-Of-Flight
Analizator czasu przelotu
TRAP
Telomeric Repeat Amplification Protocol
Protokół powielania powtórzeń telomerowych
UC
Urothelial Carcinoma
Rak urotelialny
VIP
Variable Importance in Projection
Wpływ zmiennej na projekcję
4
Wykaz publikacji stanowiących podstawę
postępowania w sprawie o nadanie stopnia
naukowego doktora nauk medycznych
1. Ossoliński, K., Ruman, T., Ossoliński, T., Ossolińska, A., Arendowski, A., Kołodziej,
A., Płaza-Altamer, A., & Nizioł, J. (2023, March). Monoisotopic silver
nanoparticles-based mass spectrometry imaging of human bladder cancer tissue:
Biomarker discovery. Advances in Medical Sciences,68(1), 38–45.
https://doi.org/10.1016/j.advms.2022.12.002 IF = 3.287, punkty MNISW = 100
2. Nizioł, J., Ossoliński, K., Płaza-Altamer, A., Kołodziej, A., Ossolińska, A., Ossoliński,
T., & Ruman, T. (2022, September 7). Untargeted ultra-high-resolution mass
spectrometry metabolomic profiling of blood serum in bladder cancer. Scientific
Reports,12(1). https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9 IF = 4.997, punkty
MNISW = 140
3. Ossoliński, K., Ruman, T., Copié, V., Tripet, B. P., Nogueira, L. B., Nogueira, K. O.,
Kołodziej, A., Płaza-Altamer, A., Ossolińska, A., Ossoliński, T., & Nizioł, J. (2022,
December). Metabolomic and elemental profiling of blood serum in bladder cancer.
Journal of Pharmaceutical Analysis,12(6), 889–900.
https://doi.org/10.1016/j.jpha.2022.08.004 IF = 14.026, punkty MNISW = 140
4. Ossoliński, K., Ruman, T., Copié, V., Tripet, B. P., Kołodziej, A., Płaza-Altamer, A.,
Ossolińska, A., Ossoliński, T., Nieczaj, A., & Nizioł, J. (2023, September). Targeted
and untargeted urinary metabolic profiling of bladder cancer. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis,233, 115473.
https://doi.org/10.1016/j.jpba.2023.115473 IF = 3.571, punkty MNISW = 100
5. Nizioł, J., Ossoliński, K., Płaza-Altamer, A., Kołodziej, A., Ossolińska, A., Ossoliński,
T., Nieczaj, A., & Ruman, T. (2023, June 16). Untargeted urinary metabolomics for
bladder cancer biomarker screening with ultrahigh-resolution mass spectrometry.
Scientific Reports,13(1). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y IF = 4.997,
punkty MNISW = 140
5
Aktywność naukowa
Studia medyczne na kierunku lekarskim ukończyłem w 2013 roku. na Warszawskim
Uniwersytecie Medycznym, gdzie podczas studiów stacjonarnych zdobyłem tytuł lekarza.
W trakcie nauki zyskałemniezwykłą możliwość odbycia staży w renomowanych klinikach
urologicznych za granicą. We wrześniu 2010 roku miałem przyjemność odbyć staż w Klinice
Urologii Uniwersytetu Maksymiliana w Monachium. Rok później, we wrześniu 2011, odbyłem
staż w Klinice Urologii Uniwersytetu Wiedeńskiego. W sierpniu i wrześniu 2012 roku miałem
okazję odbyć trzeci staż, ponownie w Klinice Urologii Uniwersytetu Maksymiliana w
Monachium
Po zakończeniu studiów medycznych rozpocząłem pracę jako lekarz stażysta w
Samodzielnym Publicznym Centralnym Szpitalu Klinicznym w Warszawie, gdzie pracowałem
od października 2013 do października 2014 roku. Następnie kontynuowałem swoją karierę
jako lekarz rezydent urologii w Szpitalu Miejskim im. Jana Pawła II, w Klinicznym Oddziale
Urologii i Urologii Onkologicznej w Rzeszowie, od lutego 2015 do lipca 2018 roku.
Kolejnym etapem mojej pracy było stanowisko lekarza rezydenta urologii w SP ZOZ,
Szpitalu im. Jana Pawła II w Kolbuszowej, na Oddziale Urologii Ogólnej i Onkologicznej,
gdzie pracuję do dziś.
Od 2015 roku jestem członkiem Polskiego, Europejskiego i Amerykańskiego Towarzystwa
Urologicznego. To ważne dla mnie, aby być częścią społeczności naukowej i mieć
możliwość wymiany wiedzy z innymi specjalistami z tej dziedziny.
W mojej karierze naukowej miałem również okazję uczestniczyć w badaniach naukowych.
Od 2015 roku przy współpracy z Wydziałem Chemicznym Politechniki Rzeszowskiej zajmuję
się badaniami nad biomarkerami metabolicznymi nowotworów układu moczowego.
W badaniach biorą również udział naukowcy z Montana State University i Oklahoma
University w Stanach Zjednoczonych oraz Federal University of Ouro Preto w Brazylii, gdzie
prowadzone są pomiary z zastosowaniem NMR i ICP-OES.
Jestem współwykonawcą poniższych grantów naukowych finansowanych przez Ministerstwo
Nauki i Szkolnictwa Wyższego oraz Narodowe Centrum Nauki, dotyczących metod
poszukiwania biomarkerów raka nerki i raka pęcherza moczowego:
- “Poszukiwanie niskocząsteczkowych biomarkerów nowotworu nerki w osoczu krwi i
w moczu z wykorzystaniem techniki AuNPET LDI MS” finansowanego przez
Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego - Diamentowy Grant nr.
0184/DIA/2016/45
- "Metody LDI MS oraz MSI w poszukiwaniu biomarkerów raka nerki" finansowanego
przez Narodowe Centrum Nauki - OPUS 12, nr UMO-2016/23/B/ST4/00062
- “Poszukiwanie oraz charakterystyka biomarkerów raka pęcherza.” finansowanego
przez Narodowe Centrum Nauki - SONATA 14, nr UMO-2018/31/D/ST4/00109
Jestem autorem i współautorem 24 publikacji naukowych z dziedziny urologii cytowanych
łącznie 270 razy. Mój h-index (indeks Hirscha) wynosi 10 (źródło: www.googlescholar.com) a
6
sumaryczny impact factor wynosi 87.53 zaś sumaryczny impact factor publikacji będących
przedmiotem pracy doktorskiej wynosi 30.878.
Posługuję się zarówno językiem angielskim jak i niemieckim co potwierdzają uzyskane
certyfikaty językowe: First Certificate in English (B2), Certificate in Advanced English (C1)
oraz Zertifikat Deutsch (B1). Moje zaangażowanie w rozwój nauki w dziedzinie urologii nie
ogranicza się tylko do pracy badawczej. Biorę również udział w licznych szkoleniach i
konferencjach w kraju i za granicą. Uważam, że ciągłe doskonalenie i nauka są kluczowe dla
zawodowego rozwoju.
7
Dorobek publikacyjny
2012
Ossoliński K,. Leczenie kolki nerkowej oraz leczenie ułatwiające wydalenie złogu. Przegląd
Urologiczny. 2012/6 (76)
Ossoliński, K; Peller, M; Gilarowska, A; Dybowski, B; Radziszewski, P; Borkowski, A; Total
survival after radical cystectomy in patients with urothelial bladder cancer. European Urology
Supplements,4,11,91,2012,
2015
Dybowski B, Ossoliński K, Ossolińska A, Peller M, Bres-Niewada E, Radziszewski P. Impact
of stage and comorbidities on five-year survival after radical cystectomy in Poland: single
centre experience. Cent European J Urol. 2015;68(3):278-83.
2016
Nizioł J, Ossoliński K, Ossoliński T, Ossolińska A, Bonifay V, Sekuła J, Dobrowolski Z,
Sunner J, Beech I, Ruman T. Surface-Transfer Mass Spectrometry Imaging of Renal Tissue
on Gold Nanoparticle Enhanced Target. Anal Chem. 2016 Jul 19;88(14):7365-71. IF = 8.008
Peller M, Balsam P, Główczyńska R, Ossoliński K, Gilarowska A, Kołtowski Ł, Grabowski M,
Filipiak KJ, Opolski G. The impact of physical training on endothelial function in myocardial
infarction survivors: pilot study. Kardiol Pol. 2016;74(5):439-46. IF = 3.71
2017
Hus K.K., Ossoliński K., Jaromin M.,Ossoliński T., Ossolińska A., Dobrowolski Z.,Groszek
G., Bocian A., Łyskowski A. Comparison of protein isolation methods from clear cell Renal
Cell Carcinoma tissue. MicroMed. 2017; 5(1): 12- 16.
2018
Nizioł J, Bonifay V, Ossoliński K, Ossoliński T, Ossolińska A, Sunner J, Beech I, Arendowski
A, Ruman T. Metabolomic study of human tissue and urine in clear cell renal carcinoma by
LC-HRMS and PLS-DA. Anal Bioanal Chem. 2018 Jun;410(16):3859-3869. IF = 4.478
Arendowski A, Nizioł J, Ossoliński K, Ossolińska A, Ossoliński T, Dobrowolski
Z, Ruman T. Laser desorption/ionization MS imaging of cancer kidney tissue on silver
nanoparticle-enhanced target. Bioanalysis. 2018 Jan;10(2):83-94. IF = 2.695
Wiechno P., Kucharz J., Sadowska M., Michalski W., Sikora-Kupis B., Jonska-Gmyrek J.,
Poniatowska G., Nietupski K., Ossolinski K., Demkow T. Contemporary treatment of
metastatic renal cell carcinoma. Med Oncol. 2018;35(12):156. IF = 3.738
2019
Ossoliński K., Nizioł J., Arendowski A., Ossolińska A., Ossoliński T., Kucharz J., Wiechno P.,
Ruman T., Mass spectrometry-based metabolomic profiling of prostate cancer - a pilot study.
Journal of Cancer Metastasis and Treatment. 2019;5:1 IF = 1.9
8
2020
Nizioł J., Sunner J., Beech I., Ossoliński K., Ossolińska A., Ossoliński T., Płaza A., Ruman
T., Localization of Metabolites of Human Kidney Tissue with Infrared Laser-Based Selected
Reaction Monitoring Mass Spectrometry Imaging and Silver-109 Nanoparticle-Based
Surface Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Anal Chem. 2020
Mar 17;92(6):4251-4258. IF = 8.008
Nizioł J, Ossoliński K, Tripet BP, Copié V, Arendowski A, Ruman T. Nuclear magnetic
resonance and surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-based serum
metabolomics of kidney cancer. Anal Bioanal Chem. 2020;412(23):5827-5841.
doi:10.1007/s00216-020-02807-1. IF = 4.478
Arendowski A, Ossolinski K, Niziol J, Ruman T. Screening of urinary renal cancer metabolic
biomarkers with gold nanoparticles - assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.
Anal Sci. 2020;10.2116/analsci.20P226. doi:10.2116/analsci.20P226. IF = 1.967
Wincewicz A, Hińcza K, Ossoliński K, et al. Evaluation of two different mutations in codon 12
of NRAS gene in ulcerated penile mucosal nodular malignant melanoma pT4b of the
90-year-old man in perspective of targeted therapy of NRAS-mutated advanced melanomas.
Dermatol Ther. 2020;e14115. doi:10.1111/dth.14115. IF = 3.858
Arendowski, Adrian, Krzysztof Ossoliński, Joanna Nizioł, and Tomasz Ruman. “Gold
Nanostructures - Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry for Kidney
Cancer Blood Serum Biomarker Screening.” International Journal of Mass Spectrometry.
Elsevier, July 27, 2020. IF = 1.934
Kowalik A, Wincewicz A, Ossoliński K, Zięba S, Kopczyński J, Ossoliński T, Góźdź S, Koda
M, Sulkowski S. Review on significance of GDNF, PTCH1 and RNF213 in chromophobe
renal cell carcinoma illustrated by the case of 71-years-old man. Pol J Pathol.
2020;71(3):195-199. IF = 0.909
2021
Nizioł J, Ossoliński K, Tripet BP, Copié V, Arendowski A, Ruman T. Nuclear magnetic
resonance and surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-based
metabolome profiling of urine samples from kidney cancer patients. J Pharm Biomed Anal.
2021 Jan 30;193:113752. doi: 10.1016/j.jpba.2020.113752. Epub 2020 Nov 6. PMID:
33197834. IF = 3.571
Arendowski A, Ossoliński K, Ossolińska A, Ossoliński T, Nizioł J, Ruman T. Serum and urine
analysis with gold nanoparticle-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry for
renal cell carcinoma metabolic biomarkers discovery. Adv Med Sci. 2021 Sep;66(2):326-335.
doi: 10.1016/j.advms.2021.07.003. Epub 2021 Jul 14. PMID: 34273747. IF = 2.852
Nizioł J, Copié V, Tripet BP, Nogueira LB, Nogueira KOPC, Ossoliński K, Arendowski A,
Ruman T. Metabolomic and elemental profiling of human tissue in kidney cancer.
Metabolomics. 2021 Mar 4;17(3):30. doi: 10.1007/s11306-021-01779-2. PMID: 33661419;
PMCID: PMC7932981. IF = 4.747
9
2022
Ossoliński, K., Ruman, T., Ossoliński, T., Ossolińska, A., Arendowski, A., Kołodziej, A.,
Płaza-Altamer, A., & Nizioł, J. (2023, March). Monoisotopic silver nanoparticles-based mass
spectrometry imaging of human bladder cancer tissue: Biomarker discovery. Advances in
Medical Sciences,68(1), 38–45. https://doi.org/10.1016/j.advms.2022.12.002 IF = 2.852
Ossoliński, K., Ruman, T., Copié, V., Tripet, B. P., Nogueira, L. B., Nogueira, K. O., Kołodziej,
A., Płaza-Altamer, A., Ossolińska, A., Ossoliński, T., & Nizioł, J. (2022, December).
Metabolomic and elemental profiling of blood serum in bladder cancer. Journal of
Pharmaceutical Analysis,12(6), 889–900. https://doi.org/10.1016/j.jpha.2022.08.004
IF = 14.26
Nizioł, J., Ossoliński, K., Płaza-Altamer, A., Kołodziej, A., Ossolińska, A., Ossoliński, T., &
Ruman, T. (2022, September 7). Untargeted ultra-high-resolution mass spectrometry
metabolomic profiling of blood serum in bladder cancer. Scientific Reports,12(1).
https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9 IF = 4.997
2023
Nizioł, J., Ossoliński, K., Płaza-Altamer, A., Kołodziej, A., Ossolińska, A., Ossoliński, T.,
Nieczaj, A., & Ruman, T. (2023, June 16). Untargeted urinary metabolomics for bladder
cancer biomarker screening with ultrahigh-resolution mass spectrometry. Scientific Reports,
13(1). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y IF = 4.997
Ossoliński, K., Ruman, T., Copié, V., Tripet, B. P., Kołodziej, A., Płaza-Altamer, A.,
Ossolińska, A., Ossoliński, T., Nieczaj, A., & Nizioł, J. (2023, September). Targeted and
untargeted urinary metabolic profiling of bladder cancer. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis,233, 115473. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2023.115473 IF = 3.571
10
Rozdział 1: Wprowadzenie
1.1 Rak pęcherza moczowego: epidemiologia, czynniki ryzyka, histopatologia i
aktualne metody diagnostyczne
1.1.1 Epidemiologia raka pęcherza moczowego
Rak pęcherza moczowego (BC) jest drugą po raku prostaty najczęstszą chorobą
nowotworową układu moczowego uwzględniając zarówno zapadalność jak i chorobowość.
W 2018 roku zdiagnozowano 550 000 nowych przypadków raka pęcherza moczowego na
świecie. Pod względem zapadalności jest szóstym najczęstszym nowotworem u mężczyzn,
siedemnastym u kobiet oraz dziesiątą co do częstości chorobą nowotworową uwzględniając
obie płcie. Standaryzowany wiekowo współczynnik zachorowalności na tę chorobę na
świecie wynosi 9.6 na 100 000 dla mężczyzn i 2.4 na 100 000 dla kobiet. W 2018 roku z
powodu raka pęcherza moczowego zmarło 200 000 osób, co uplasowało go na trzynastym
miejscu pod względem śmiertelności spowodowanej chorobami nowotworowymi na świecie i
na drugim miejscu (po raku prostaty) pod względem śmiertelności spowodowanej
nowotworami układu moczowego. Standaryzowany wiekowo współczynnik śmiertelności
wynosi 3.2 na 100 000 dla mężczyzn i 0.9 na 100 000 dla kobiet. W porównaniu z 2008
rokiem zapadalność na raka pęcherza wzrosła z 5.3 na 100 000 ludności do 5.7 na 100 000
ludności, zaś śmiertelność spadła z 2 na 100 000 ludności do 1.9 na 100 000 ludności [1,2].
1.1.2 Czynniki ryzyka rozwoju raka pęcherza moczowego
1.1.2.1 Wiek, płeć, rasa,
Według danych American Cancer Society mężczyźni są 3-4 razy bardziej narażeni na
rozwój raka pęcherza moczowego niż kobiety, prawdopodobnie z powodu zwiększonego
odsetka palaczy tytoniu oraz narażenia na działanie toksyn środowiskowych. W swoim życiu
mężczyźni mają 3.8% szansy na rozwój raka pęcherza moczowego i jest to 3-krotnie
większe prawdopodobieństwo niż w przypadku kobiet. Zapadalność osób z białym kolorem
skóry jest 2-krotnie wyższa niż w przypadku Afroamerykanów i Azjatów. Najwyższa
śmiertelność spowodowana rakiem pęcherza moczowego dotyczy białych mężczyzn.
Średnio mężczyźni mają 3-krotnie większą śmiertelność niż kobiety a osoby z białym
kolorem skóry 1.5 raza większą w porównaniu z Afroamerykanami i 3 razy większą w
porównaniu z Azjatami.
Wiek również w istotnym stopniu wpływa na prawdopodobieństwo zachorowania na raka
pęcherza moczowego. Osoby obu płci z przedziału 0-49 lat mają 0.1% ryzyka zachorowania,
50-59 lat - 0.2%, 60-69 lat - 0.5%, ponad 70 lat - 2.2%. W przeciwieństwie do wielu innych
nowotworów u osób młodszych (poniżej 40 roku życia) występuje tendencja do rozwoju
mniej agresywnego raka pęcherza moczowego [3,4].
1.1.2.2 Czynniki genetyczne
Obserwuje się 2-krotne zwiększone ryzyko rozwoju choroby u krewnych pierwszego stopnia
chorych na raka pęcherza moczowego. Uważa się, że w przeciwieństwie do postaci
dziedzicznych nowotworów, rak pęcherza moczowego jest wielogenową chorobą
11
nowotworową spowodowaną wieloma genami o niskiej penetracji bez wyraźnych cech
dziedziczenia mendlowskiego [5].
1.1.2.3 Palenie tytoniu
Palenie tytoniu jest najważniejszym czynnikiem ryzyka rozwoju raka pęcherza moczowego i
szacuje się, że odpowiada za 50 % jego wszystkich przypadków. Dym tytoniowy zawiera
ponad 60 różnych substancji rakotwórczych i uważa się, że palenie ma związek z
powstawaniem co najmniej 18 różnych nowotworów. Związki tj. aromatyczne aminy
(β-naftyloamina) oraz policykliczne aromatyczne węglowodory wydalane są przez nerki i
wywierają kancerogenny wpływ na cały układ moczowy. Ryzyko rozwoju raka pęcherza
moczowego u palaczy jest 2-4 krotnie większe niż u nie-palaczy a intensywność i czas
trwania palenia są wprost proporcjonalne do wzrostu ryzyka. Co istotne ryzyko rozwoju raka
pęcherza moczowego zmniejsza się z czasem od momentu rzucenia nałogu jednak nie
osiąga poziomu populacyjnego. Szacuje się, że nawet 20 lat po rzuceniu nałogu ryzyko
nadal jest 2-krotnie większe. Palenie wpływa również na częstość nawrotów oraz ryzyko
progresji do raka pęcherza naciekającego mięśniówkę [6,7].
1.1.2.4 Narażenie zawodowe
Zawodowe narażenie na kancerogeny, po paleniu tytoniu, uznawane jest za drugi
najważniejszy czynnik etiologiczny powstawania raka pęcherza moczowego. Około 20%
przypadków związane jest z narażeniem na takie czynniki jak aminy aromatyczne,
policykliczne aromatyczne węglowodory, węglowodory chlorowane, które powstają w
przemyśle barwiarskim, gumowym, metalowym, petrochemicznym i rafineryjnym [6]. Uważa
się, że istnieje długi okres karencji wynoszący 10-20 lat pomiędzy narażeniem na
kancerogeny przemysłowe a powstaniem raka pęcherza moczowego [6,8].
1.1.2.6 Zapalenie pęcherza moczowego
Najbardziej wyraźny związek pomiędzy przewlekłym zapaleniem pęcherza moczowego a
ryzykiem rozwoju raka obserwuje się w wyniku zakażenia Schistosoma haematobium i
Schistosoma mansoni. Endemicznym miejscem występowanie tych przywr jest Egip. W
latach 60 XX wieku ogólna częstość występowania infekcji wynosiła 40% i zmniejszyła się w
2010 roku do poziomu <0.3% w efekcie rządowej kampanii antybilharzialnej [9]. Mechanizm
kancerogenezy w przypadku zakażenia przywrami nie jest całkowicie poznany. Podejrzewa
się, że główną rolę odgrywają przewlekły proces zapalny i narażenie na działanie czynników
środowiskowych, które mogą generować genotoksyczne substancje w moczu tj.
nitrozoaminy. Substancje te są wytwarzane w bardzo wysokiej ilości w moczu pacjentów
przewlekle zakażonych Schistosomą i są znanym rakotwórczym czynnikiem rozwoju raka
pęcherza moczowego.
1.1.3 Histopatologia nowotworów pęcherza moczowego
Prawidłowa budowa pęcherza moczowego składa się z czterech warstw: błony śluzowej,
błony podśluzowej, warstwy mięśniowej oraz warstwy surowiczej. Błona śluzowa wyłożona
jest przez wyspecjalizowany nabłonek przejściowy zwany urotelium. Jest on wynikiem
adaptacji do drażniącego środowiska jakim jest mocz. Składa się z 3-6 warstw komórek.
12
Istnieją dwa podtypy komórek nabłonka urotelialnego: komórki baldaszkowate, które
pokrywają powierzchnię i mają bezpośredni kontakt z moczem oraz komórki leżące u ich
podstaw, które stanowią zewnętrzną warstwę. Szczytowa błona komórkowa komórek
baldaszkowatych składa się z białkowych płytek zbudowanych z uroplakiny, połączonych
zawiasowymi obszarami normalnej błony. Tworzy ona nieprzepuszczalną dla wody i jonów
barierę osmotyczną. Warstwa podstawna urotelium opiera się na błonie podstawnej. Pod
błoną podstawną znajduje się blaszka właściwa (lamina propria) błony śluzowej. Jest to
luźna strefa składająca się z tkanki łącznej, zawierającej cienkie i delikatne naczynia
krwionośne oraz wiązki gładkich włókien mięśniowych, zwanych warstwą mięśniową
śluzówki (muscularis mucosae). Jest mocno zróżnicowana, w niektórych miejscach składa
się z niekompletnej warstwy włókien mięśni gładkicg aż do pełnej warstwy podobnej do tej w
jelicie grubym. Tkanka łączna pod warstwą mięśniową śluzówki zawiera arkada większych
naczyń krwionośnych. Pod spodem znajduje się właściwa warstwa mięśniowa (muscularis
propria) składająca się z grubych wiązek włókien mięśniowych i niewielkiej ilości luźnej
tkanki łącznej [10].
Rak pęcherza moczowego jest nowotworem złośliwym rozwijającym się zwykle w błonie
śluzowej pęcherza moczowego. Najczęstsze typy histopatologiczne tego nowotworu to rak
urotelialny, rak płaskonabłonkowy i gruczolakorak.
Rak urotelialny
Rak urotelialny jest najczęstszym typem raka pęcherza moczowego - stanowi około 90%
wszystkich przypadków. Ten typ nowotworu powstaje z komórek urotelialnych
wyściełających wnętrze pęcherza moczowego. Głównym kryterium podziału nowotworów
pęcherza moczowego jest głębokość naciekania na ścianę pęcherza moczowego. 75%
przypadków stanowi tzw. rak pęcherza nienaciekający mięśniówki (non-muscle invasive
bladder cancer, NMIBC) i obejmuje błonę śluzową (Ta, CIS) oraz podśluzową (T1).
Pozostałe 25% stanowi rak pęcherza moczowego naciekający mięśniówkę (muscle invasive
bladder cancer, MIBC). Głębokość naciekania ściany pęcherza jest istotna klinicznie ze
względu na wybór metody leczenia oraz fakt, że pacjenci z MIBC znajdują się w grupie
najwyższego ryzyka śmiertelności spowodowanej nowotworami złośliwymi. Istnieje kilka
wzorców wzrostu raka urotelialnego w tym typ płaski, brodawkowaty (egzofityczny),
odwrócony (endofityczny) oraz lity, uszypułowany. NMIBC obejmuje zmiany takie jak rak
in-situ (Carcinoma in situ, CIS), brodawczakowaty nowotwór urotelialny o niskim potencjale
złośliwości (ang. Papillary Urothelial Neoplasm of Low Malignant Potential, PUNLMP),
niskiego stopnia złośliwości rak brodawczakowy (Low Grade Bladder Cancer, LG BC) oraz
wysokiego stopnia złośliwości rak brodawczakowy (High Grade Bladder Cancer, HG BC)
[10,11,12].
Rak płaskonabłonkowy
Rak płaskonabłonkowy pęcherza moczowego jest rzadkim typem, stanowiącym około 1-2%
wszystkich nowotworów pęcherza moczowego w Stanach Zjednoczonych i Europie. W
Egipcie i Zimbabwe obserwuje się największy odetek płaskonabłonkowych raków pęcherza
moczowego na świecie. Wiąże się to z przewlekłym, endemicznym zapaleniem pęcherza
moczowego spowodowanym przez przywry z gatunku Schistosoma. Drugą populacją
szczególnie narażoną na zwiększone ryzyko raka płaskonabłonkowego pęcherza
13
moczowego są pacjenci po urazie kręgosłupa. Podejrzewa się, że jest to wywołane
drażnieniem ściany pęcherza moczowego poprzez przewlekłe cewnikowanie oraz
nawracające infekcje [14].
Gruczolakorak
Gruczolakorak to kolejny rzadki typ raka pęcherza moczowego, stanowiący około 1%
wszystkich przypadków. Ten typ wywodzi się z komórek gruczołowych pęcherza
moczowego. Wyróżnia się dwa rodzaje raków gruczołowych pęcherza moczowego -
wywodzące się z moczownika, pasmo tkanki łącznej będące pozostałością omoczni (⅓
przypadków), oraz pierwotne gruczolakoraki pęcherza moczowego (⅔ przypadków)
[15,16,17].
Rak drobnokomórkowy
Rak drobnokomórkowy pęcherza moczowego jest bardzo rzadką i agresywną formą raka
pęcherza moczowego, która stanowi mniej niż 1% wszystkich nowotworów pęcherza
moczowego. Jest to nowotwór neuroendokrynny, co oznacza, że zaczyna się w komórkach,
które uwalniają hormony w odpowiedzi na sygnały z układu nerwowego. Komórki raka
drobnokomórkowego są mniejsze niż większość innych komórek nowotworowych, a ten typ
raka jest zwykle bardzo agresywny i często w momencie diagnozy obecne są przerzuty [13].
Inne podtypy histopatologiczne
Istnieje kilka innych podtypów histopatologicznych raka pęcherza moczowego, ale są one
niezwykle rzadkie i z reguły bardzo agresywne. Należą do nich odmiany raka urotelialnego
takie jak: rak urotelialny z gniazdami (nested variant of urothelial carcinoma), rak urotelialny
mikrobrodawkowaty (micropapillary urothelial carcinoma) oraz rak plazmocytoidalny
(plasmocytoid urothelial carcinoma) [10,13]. Wyróżnia się również raki sarkomatoidalne,
limfoepitelialne, mięsaki i raki jasnokomórkowe [13]. W Tabeli 1 podsumowano wszystkie
postacie histopatologiczne nowotworów pęcherza moczowego.
1.1.4 Grading i staging raka pęcherza moczowego
Celem oceny stopnia zaawansowania raka pęcherza moczowego stosuje się pochodzącą z
2002 roku i zaktualizowaną w 2009 roku klasyfikację TNM. Do oceny zróżnicowania
histopatologicznego używa się klasyfikacji Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) z 1973
roku lub zaktualizowanej wersji WHO i International Society of Urological Pathology (IUSP),
którą zaproponowano w 1998 roku i którą WHO przedstawiła w 2004 roku. Klasyfikacja ta
uwzględnia zarówno zmiany płaskie (hiperplazja, atypia reaktywna, atypia nieznanego
charakteru, dysplazja nabłonka urotelialnego i rak śródnabłonkowy CIS), jak i zmiany
brodawczakowate (brodawczak przejściowokomórkowy, brodawczakowy nowotwór nabłonka
o niskim potencjale złośliwości, niskiego stopnia złośliwości brodawczakowy rak nabłonka,
wysokiego stopnia złośliwości brodawczakowy rak nabłonka). Większość dotychczasowych
badań nad rakiem pęcherza moczowego została przeprowadzona z zastosowaniem
klasyfikacji WHO z 1973 roku, w związku z czym Europejskie Towarzystwo Urologiczne
(European Association of Urology - EAU) zaleca stosowanie obydwu klasyfikacji WHO do
czasu sprawdzenia prognostycznej roli klasyfikacji WHO z 2004 roku. W 2016 roku
14
opublikowano nową klasyfikację WHO nowotworów pęcherza moczowego z niewielkimi
zmianami w stosunku do klasyfikacji z 2004 roku [18]. Tabele 2 i 3 podsumowują grading i
staging raka pęcherza moczowego.
Tabela 1. Histopatologiczne postacie nowotworów pęcherza moczowego (WHO 2004).*
Nowotwór urotelialny
-Łagodny
Brodawczak urotelialny
Odwrócony brodawczak
- Brodawczakowy nowotwór urotelialny o niskim
potencjale złośliwości
- Brodawczak złośliwy
Rak brodawczakowy, niski potencjał złośliwości
Rak brodawczakowy, wysoki potencjał złośliwości
Rak brodawczakowy z różnicowaniem
płaskonabłonkowym lub gruczołowym
- Złośliwy, nie-brodawczakowy
Płaski rak in situ
Rak naciekający
Odmiany raka naciekającego
Z gniazdami
Drobnokanalikowy
Mikrotorbielowaty
Odwrócony
Z różnicowaniem płaskonabłonkowym
Z różnicowaniem gruczołowym
Mikrobrodawkowaty
Rak mięsakowaty
Rak jasnokomórkowy
Plazmocytoidalny
Z syncytiotrofoblastem
Z nietypowym odczynem zrębu
Zrąb pseudomięsakowaty
Zrąb kostny lub metaplazja chrzęstnokomórkowa
Rak olbrzymiokomórkowy, typ osteoklastyczny
Z zaznaczonym naciekiem limfoidalnym
Rak płaskonabłonkowy
Typ zwykły
Odmiana
Brodawkowaty
Bazaloidalny
Z cechami mięsaka
Gruczolakorak
Typ jelitowy
Śluzowy
Z komórek sygnetowatych
Jasnokomórkowy
Rak hepatoidalny
Gruczolakorak, niesklasyfikowany inaczej
Guz składający się z mieszanych komórek
Raki niezróżnicowane
Rak drobnokomórkowy
Rak wielkokomórkowy, neuroendokrynny
Rak typu nabłoniaka limfatycznego
Rak olbrzymiokomórkowy
Raki niezróżnicowane
Przerzut
*Opracowano na podstawie: Lopez-Beltran A. Bladder cancer: clinical and pathological profile. Scand J Urol
Nephrol Suppl 2008;218:95–109.
15
Tabela 3. Klasyfikacja TNM raka pęcherza moczowego*.
T - Guz pierwotny
TX
Brak możliwości oceny guza pierwotnego
T0
Brak guza pierwotnego
Ta
Nienaciekający rak brodawczakowaty
Tis
Rak śródnabłonkowy (in situ)
T1
Guz nacieka podnabłonkową tkankę łączną
T2
T2a
Guz nacieka połowę wewnętrznej warstwy mięśniowej
T2b
Guz nacieka całą mięśniówkę
T3
T3a
Guz nacieka mikroskopowo tkankę okołopęcherzową
T3b
Guz nacieka makroskopowo tkankę okołopęcherzową
T4
T4a
Guz nacieka stercz, macicę i pochwę
T4b
Guz nacieka ścianę miednicy lub powłoki brzuszne
N - Węzły chłonne
NX
Brak możliwości oceny regionalnych węzłów chłonnych
N0
Brak przerzutów do regionalnych węzłów chłonnych
N1
Przerzut do pojedynczego węzła chłonnego w obrębie miednicy właściwej
N2
Przerzut do wielu węzłów chłonnych w obrębie miednicy właściwej
N3
Przerzut do jednego lub wielu węzłów chłonnych biodrowych wspólnych
M - Przerzuty
MX
Brak możliwości ocen odległego przerzutu
M0
Brak przerzutów odległych
M1
Przerzuty odległe
*Opracowano na podstawie wytycznych postępowania dotyczących raka pęcherza moczowego Europejskiego
Towarzystwa Urologicznego, tłumaczenie Polskiego Towarzystwa Urologicznego.
16
1.1.5 Diagnostyka raka pęcherza moczowego
Najczęstszym objawem raka pęcherza moczowego jest krwiomocz i występuje on u 85%
pacjentów z nowo rozpoznanym guzem pęcherza moczowego. Bezobjawowy krwinkomocz
pojawia się niemal u wszystkich pacjentów. Definiowany jest przez Amerykańskie
Towarzystwo Urologiczne (AUA) jako obecność ⋝3 erytrocytów w mikroskopowej ocenie
osadu moczu w dwóch z trzech prawidłowo pobranych próbek moczu. Ocenia się, że niesie
ze sobą 5,4% ryzyka obecności nowotworu układu moczowego i 4,1% ryzyka obecności
guza pęcherza moczowego [19]. Z tego względu AUA zaleca pełne badanie jak w przypadku
krwiomoczu z uwzględnieniem tomografii komputerowej, cystoskopii i badania
cytologicznego moczu [20]. Nowotwory pęcherza moczowego zwykle nie powodują bólu
oraz rzadko współwystępują z objawami pochodzącymi z dolnych części układu
moczowego. Wyjątkiem jest CIS, który może dawać podrażnieniowe objawy ze strony
dolnych dróg moczowych, tj. parcia naglące i częstomocz.
Każda diagnostyka krwiomoczu powinna obejmować sumiennie zebrany wywiad dotyczący
czynników ryzyka raka pęcherza moczowego, w tym palenia tytoniu, informacji na temat
miesiączki, obecności dodatkowych objawów, tj. bólu czy pieczenia przy oddawaniu moczu
oraz informacji na temat niedawno przebytych zabiegów urologicznych i ginekologicznych.
Celem wstępnej oceny pacjenta z krwiomoczem wykorzystuje się przezbrzuszne badanie
ultrasonograficzne. Pozwala ono na wykrycie zmian ogniskowych w nerkach, wpuklający się
do światła pęcherza moczowego guzów oraz wodonercza jako objawu pośredniego w
niektórych nowotworach układu moczowego. Ograniczenia diagnostyki przy użyciu
ultrasonografu wynikają z braku możliwości wykluczenia raka urotelialnego górnych dróg
moczowych. Pełna diagnostyka krwiomoczu powinna obejmować wziernikowanie pęcherza
moczowego (cystoskopia), badanie cytologiczne moczu oraz badanie obrazowe górnych i
dolnych dróg moczowych (urograficzną tomografię komputerową jamy brzusznej i miednicy).
Badanie obrazowe wykonuje się głównie w celu wykrycia nowotworów urotelialnych górnego
odcinka dróg moczowych (upper tract urothelial carcinoma, UTUC).
Podstawowym badaniem diagnostycznym w przypadku podejrzenia raka pęcherza
moczowego jest cystoskopia. Pozwala ona na uwidocznienie zmiany i pobranie wycinka do
badania histopatologicznego. Zwykle wykonywana jest w warunkach ambulatoryjnych przy
użyciu sztywnego albo coraz częściej giętkiego cystoskopu. Badanie cystoskopowe
uzależnione jest w dużym stopniu od doświadczenia lekarza przeprowadzającego badanie
oraz jakości użytego sprzętu. Ocenia się, że 4-27% guzów zostaje pominiętych przy
badaniu. Wartość ta wzrasta do 32-77% w przypadku zmian o charakterze CIS [21].
Wraz z postępem technologii i lepszym zrozumieniem zmian metabolicznych zachodzących
w nowotworach pęcherza moczowego wprowadzono kilka modyfikacji badania
cystoskopowego, które zwiększają jego czułość. Przykładem jest tzw. cystoskopia
fluorescencyjna/diagnostyka fotodynamiczna (photodynamic diagnosis, PDD). Metoda ta jest
praktycznym przykładem na to, jak zmieniony metabolizm komórek nowotworowych może
przyczyniać się do poprawy diagnostyki i leczenia nowotworu.
17
Polega na wykorzystaniu w badaniu cystoskopowym światła niebieskiego po uprzednim
wykonaniu wlewki dopęcherzowej ze środkiem fotouczulającym takim jak kwas
5-aminolewulinowy (5-ALA) lub kwas heksaminolewulinowego (HAL). Wszystkie komórki
nabłonka urotelialnego go pochłaniają, jest on jednak nadmiernie gromadzony przez szybko
dzielące się komórki nowotworowe (10-krotnie wyższy poziom). Badania wykazały, że
wskaźnik wykrywalności guza pęcherza moczowego wynosi 73-96% w przypadku
cystoskopii w białym świetle w porównaniu z 90-96% w przypadku cystoskopii
fluorescencyjnej. PDD jest szczególnie pomocne w wykrywaniu CIS -wskaźniki
wykrywalności wynoszą 23-68% w przypadku cystoskopii w białym świetle w porównaniu z
91-97% w przypadku cystoskopii fluorescencyjnej [22,23].
1.1.6 Markery nowotworowe raka pęcherza moczowego
1.1.6.1 Wstęp
Obecne narzędzia diagnostyczne i prognostyczne stosowane w diagnostyce raka pęcherza
moczowego, takie jak cystoskopia i cytologia, mają ograniczenia w zakresie czułości i
swoistości. Markery nowotworowe mogłyby stanowić alternatywę dla tego inwazyjnego i
kosztownego badania.
Wczesna diagnoza i dokładnie określenie stopnia zaawansowania klinicznego i złośliwości
histopatologicznej są kluczowe dla skutecznego leczenia i poprawy wskaźników przeżycia
każdego nowotworu w tym raka pęcherza moczowego. Jednym z obiecujących podejść do
osiągnięcia tych celów jest identyfikacja i charakterystyka biomarkerów, które są mierzalnymi
wskaźnikami procesów biologicznych związanych z chorobą. Biomarkery mogą dostarczyć
ważnych informacji na temat mechanizmów rozwoju i progresji raka pęcherza moczowego, a
także służyć jako narzędzia diagnostyczne i prognostyczne. Ich znaczenie obejmuje
wczesne wykrywanie, gdzie mogą być używane jako nieinwazyjne narzędzia pomagające w
identyfikacji raka pęcherza moczowego, nawet zanim pojawią się objawy lub staną się one
widoczne w badaniach obrazowych. Wczesne wykrycie może znacznie poprawić wyniki
leczenia pacjentów. Co więcej, biomarkery związane z agresywnymi formami raka pęcherza
moczowego mogą pomóc klinicystom w stratyfikacji pacjentów na podstawie ich ryzyka,
oferując spersonalizowane opcje leczenia. Biomarkery można również wykorzystywać w
celu monitorowania skuteczności terapeutycznej i wykrywania wczesnych oznak nawrotu, co
ma zastosowanie w nowotworach dróg moczowych, tj. raku prostaty czy rak jądra. Biorąc
pod uwagę wysoki wskaźnik nawrotów raka pęcherza moczowego, ma to kluczowe
znaczenie.
W erze medycyny spersonalizowanej biomarkery są kluczowe do podejmowania decyzji o
wyborze odpowiedniej terapii celowanej. Wraz z głębszym zrozumieniem raka pęcherza
moczowego na poziomie molekularnym, pojawiają się terapie ukierunkowane na określone
mutacje genetyczne lub nieprawidłowości molekularne związane z rakiem pęcherza
moczowego. Przykładem może być ekspresja ligandu programowanej śmierci 1 (PD-L1) ,
którego ekspresja pozwala na dobór leczenia w przerzutowym raku pęcherza moczowego.
W przypadku raka pęcherza moczowego zastosowanie biomarkerów może umożliwić
wczesne wykrywanie, stratyfikację ryzyka, monitorowanie leczenia i personalizację terapii,
prowadząc do poprawy wyników leczenia pacjentów.
18
Dobry marker nowotworowy powinien charakteryzować się małą inwazyjnością sposobu
jego pobierania (najlepiej z moczu lub surowicy), powinien być szybki i łatwy do oznaczenia
obiektywny do oceny i interpretacji, o wysokiej czułość i swoistości. Marker raka pęcherza
moczowego byłyby użyteczny zarówno do badań przesiewowych, jako element diagnostyki
pacjentów z krwiomoczem lub innymi objawami sugerującymi raka pęcherza moczowego
jak i w celu obserwacji pacjentów z rakiem pęcherza moczowego celem wczesnej
identyfikacji nawrotów i zapobieganiu progresji choroby. Ze względu na stosunkowo niską
zapadalność na raka pęcherza moczowego, badanie przesiewowe całej populacji nie byłoby
opłacalne ekonomicznie [24]. Jednakże screening osób narażonych na znane czynniki
rakotwórcze tj. palaczy, pracowników przemysłu barwiarskiego, gumowego, metalowego,
petrochemicznego i rafineryjnego oraz osób po radioterapii w obrębie miednicy może być
korzystyny dla wczesnego wykrywania raka pęcherza moczowego. Taki biomarker miałby
również potencjał do zredukowania liczby lub poprawy jakości kontrolnych cystoskopii.
Lokeshwar i wsp. sprecyzowali dokładnie jakie cechy powinien mieć klinicznie użyteczny
marker raka pęcherza moczowego, powołując Międzynarodowy Panel Porozumienia ds.
Markerów Raka Pęcherza Moczowego (International Consensus Panel on Bladder Tumor
Markers) [25]. Po pierwsze idealny marker raka pęcherza moczowego powinien być
technicznie prosty do pobrania. Następnie powinien cechować się odpowiednią
dokładnością diagnostyczną, co jest określane za pomocą parametrów, takich jak: czułość,
swoistość, pole pod krzywą ROC (Area Under Curve, AUC), wartość predykcyjna dodatnia i
wartość predykcyjna ujemna. Ostatnim, ale nie mniej ważnym parametrem idealnego
markera raka pęcherza moczowego jest jego koszt.
Szacuje się, że pod względem kosztów leczenia i diagnostyki rak pęcherza moczowego
należy do najdroższych ze wszystkich nowotworów. Koszt leczenia od momentu diagnozy
do śmierci wynosi od 89 000 USD do nawet 202 000 USD. Cystoskopia w połączeniu z
badaniem cytologicznym jest podstawowym badaniem we wstępnej diagnostyce, a
następnie kontroli pacjenta po leczeniu. W Polsce badanie to wyceniane jest na kwotę około
200 euro zaś w Wielkiej Brytaniii to koszt nawet 600 euro [26]. W przypadku guzów o
wysokim ryzyku follow-up obejmuje kontrolną cystoskopię co 3 miesiące przez okres 2 lat, a
następnie co 6 miesięcy do zakończenia okresu 5-letniego, później raz w roku oraz
regularne (co roku) wykonywanie badań obrazowych górnych dróg moczowych (tomografia
komputerowa). Jest to więc duże obciążenie zarówno dla pacjenta jak i dla systemu opieki
zdrowotnej.
1.1.6.2 Cytologia moczu
Cytologia moczu jest pierwszym i szeroko dostępnym klinicznie markerem raka
urotelialnego. Została wprowadzona po raz pierwszy przez Papanicolaou w 1945 roku i
polega na poszukiwaniu złuszczonych komórek nowotworowych w moczu lub popłuczynach
z pęcherza moczowego. Czułość i swoistość tej metody wynosi odpowiednio 11-76% i
>90%. Oznacza to, że dodatni wynik jest niemal diagnostyczny dla nowotworu
nabłonkowego w obrębie układu moczowego. Nie wskazuje on jednak na miejsce rozwoju
nowotworu - rak może się znajdować zarówno w układzie kielichowo-miedniczkowym,
moczowodzie jak i pęcherzu moczowym. Z uwagi na niską czułość badania cytologicznego
moczu w pzypadku nowotworów o niskim stopniu złośliwości (4-31%) ujemny wynik nie
wyklucza obecności nowotworu w drogach moczowych. Wartość cytologii jest duża w
19
przypadku guzów o wysokim stopniu złośliwości i CIS, ponieważ dochodzi do utraty
spójności między komórkami nabłonka co prowadzi do złuszczania się dużej ilości komórek.
Na wynik badania cytologicznego moczu mają wpływ takie czynniki jak doświadczenie
oceniającego patologa, łagodne schorzenia w obrębie dróg moczowych, tj. zakażenie dróg
moczowych, kamica moczowa a także stan po leczeniu BCG [27].
1.1.6.3 Inne markery raka pęcherza moczowego
W celu zniwelowania ograniczeń aktualnych metod diagnostyki raka pęcherza moczowego
prowadzone są badania mające na celu wykrycie biomarkerów występujących w surowicy
lub moczu. Związki te mogą odzwierciedlać różne aspekty biologii raka pęcherza
moczowego, takie jak zmiany w ekspresji genów, metylacji DNA, ekspresji białek, szlaków
metabolicznych i mikrośrodowiska guza. W Tabeli 5 przedstawiono podsumowanie i
przegląd komercyjnie dostępnych markerów raka pęcherza moczowego. Żaden z tych
markerów nie został jednak zaakceptowany do rutynowej diagnostyki przez towarzystwa
urologiczne. Europejskie Towarzystwo Urologiczne wylicza ich główne cechy:
- czułość jest zwykle wyższa kosztem niższej swoistości w porównaniu z cytologią
moczu;
- łagodne schorzenia dróg moczowych, tj. infekcje, kamica moczowa i terapia BCG,
mogą wpływać na wyniki tych testów;
- niska powtarzalność niektórych testów może być wyjaśniona przez dobór pacjentów
oraz skomplikowanymi metodami laboratoryjnymi;
- dodatni wynik badań cytologicznych, UroVysion, NMP22, FGFR 3, TERT i analizy
mikrosatelitarnej u pacjentów z negatywnym wynikiem badania cystoskopowego i
badania obrazowego górnych dróg moczowych może zidentyfikować pacjentów z
większym prawdopodobieństwem nawrotu i progresji choroby nowotworowej;
- cztery z komercyjnie dostępnych biomarkerów z moczu: Cx-Bladder, ADX-Bladder,
Xpert Bladder i EpiCheck mają czułość i ujemne wartości predykcyjne porównywalne
z badaniem cystoskopowym. Te cztery testy mogą być wykorzystane do zastąpienia
i/lub odroczenia cystoskopii, ponieważ mogą zidentyfikować rzadkie nawroty raka
pęcherza moczowego nie-naciekającym mięśniówki o wysokim stopniu złośliwości
histopatologicznej.
20
Tabela 5. Komercyjnie dostępne markery nowotworowe raka pęcherza moczowego.
Rodzaj
Nośnik
Marker
Czułość
(%)
Swoistość
(%)
Wykrywany związek
Typ testu
Rejestracja
FDA
Dostępny w
Polsce?
białkowe
mocz
BTA-Stat
36-89
50-70
białko związane z czynnikiem H dopełniacza
test przyłóżkowy
follow-up
tak, 120zł
mocz
BTA-TRAK
57-83
~90
białko związane z czynnikiem H dopełniacza
sandwich ELISA
-
mocz
NMP-22
47-100
56
55-80
86
białko jądrowego aparatu mitotycznego
(NuMA)
sandwich ELISA
follow-up
-
mocz
test przyłóżkowy
diagnostyka
follow-up
tak, 130zł
mocz
BLCA-4
89-96
100
białko macierzy jądrowej
ELISA
-
-
mocz
Surwiwina
64-100
87-100
białko z rodziny inhibitorów apoptozy
immunoblotting przy użyciu
systemu mikrofiltracji BioDot
-
-
mocz
UBC
36-79
88-92
cytokeratyna 8 i 18
test przyłóżkowy
-
tak, 150zł
mocz
sandwich ELISA
-
-
mocz
CYFRA 21-1
75-97
67-71
cytokeratyna 19
test immunoradiometryczny
lub ELISA
-
tak, 50zł
oparte na badaniu
cytologicznym
mocz
Cytologia
11-76
>90
komórki nowotworowe
badanie mikroskopowe
nd.
tak, 100zł
mocz
DD23
73-100
33-67
antygen związany z nowotworem, 185-kDa
test immunocytochemiczny
-
-
mocz
Immunocyt/uCyt+
38-90
73-80
CEA, dwie mucyny związane z komórkami
nowotoworu pęcherza moczowego
test immunocytochemiczny
follow-up
-
genetyczne
mocz
UroVysion
68-87
>90
aneuploidia chromosomu 3,7,17
delecja locus 9p21
wielokolorowy FISH
diagnostyka
follow-up
tak, 1000zł
mocz
Telomeraza (TRAP)
70-90
60-70
aktywność enzymu - telomerazy
TRAP
-
-
mocz
CxBladder
82
85
5 fragmentów mRNA: MDK, HOXA13, CDC2,
IGFBP5, CXCR2
RT-PCR
-
-
mocz
AssureMDX
93-97%
83-86%
metylacja genów: OTX1, ONECUT2, TWIST1
mutacji genów: FGFR3, TERT, HRAS
MSP + sekwencjonowanie
nowej generacji
-
-
Inne markery, niedostępne komercyjnie.
genetyczne
mocz
Analiza mikrosatelitarna
72-97
>95
polimorfizm krótkich powtórzeń tandemowych
RT-PCR
-
-
mocz
Telomeraza (hTERT)
83-95
60-70
hTERT
RT-PCR
-
-
mocz
Cytokeratyna 20
82-87
55-70
mRNA cytokeratyny 20
RT-PCR
-
-
białkowe
mocz
HA-HAase
88-94
67-71
kwas hialuronowy i hialuronidaza
ELISA
-
-
1.2 Metabolomika: zastosowanie w badaniach nad nowotworami
Metabolomika jest dziedziną nauki zajmująca się badaniem procesów metabolicznych
zachodzących w organizmie poprzez analizę jakościową i ilościową małocząsteczkowych
związków, metabolitów i szlaków biologicznych w których występują. Metabolity zazwyczaj
są związkami chemicznymi o masie cząsteczkowej poniżej 1500 Da i należą do nich
węglowodany, lipidy, aminokwasy, kwasy tłuszczowe, kwasy organiczne, nukleotydy, sterydy,
alkaloidy, witaminy, fenole i wiele innych. Metabolomika, będąca końcowym produktem
procesów komórkowych, zapewnia funkcjonalny odczyt biochemii komórkowej i może
zaoferować nieoceniony wgląd w fizjologiczny i patologiczny stan organizmu. W kontekście
badań nad nowotworami - metabolomika stała się potężnym narzędziem do zrozumienia
złożonego biochemicznego krajobrazu komórek nowotworowych i ich mikrośrodowiska.
Profil metabolomiczny komórki nowotworowej odzwierciedla przeprogramowane szlaki
metaboliczne, które napędzają jej niekontrolowany wzrost, przetrwanie i inwazję, a profile te
mogą być wykorzystane do celów diagnostycznych, prognostycznych i terapeutycznych.
Metabolomika wraz z genomiką, transkryptomiką, proteomiką stanowią element tzw. biologii
systemowej, zajmującej się badaniem złożonych i skomplikowanych oddziaływań
zachodzących w systemach biologicznych (Schemat 1).
Schemat 1. Dziedziny biologii systemowej: genomika, transkryptomika, proteomika i
metabolomika
22
Metabolomika ma szereg teoretycznych przewag nad innymi dziedzinami badania biologii
systemów. Jest najszybszym systemem reakcji organizmu na bodźce i zmiany, co najlepiej
pozwala na ocenę jego aktualnego stanu. Profil metaboliczny można traktować jako
wypadkową reakcji organizmu na czynniki genetyczne, czynniki środowiskowe, aktywność
fizyczną, dietę, choroby i zastosowane leczenie. W przeciwieństwie do genów i białek,
których funkcje podlegają odpowiednio regulacji epigenetycznej i modyfikacjom
potranslacyjnym, metabolity są bezpośrednią sygnaturą aktywności biochemicznej
organizmu i są najdokładniejszą reprezentacją fenotypu. Dużą zaletą badań
metabolomicznych jest ich stosunkowo niski koszt i możliwość szybkiej analizy.
1.3 Metody analizy chemicznej stosowane w metabolomice
W badaniach metabolomicznych stosowane są głównie dwie podstawowe metody
analityczne: spektrometria mas (MS) i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego
(NMR). Obie techniki mają swoje unikalne zalety i ograniczenia, które wpływają na ich
zastosowanie w konkretnych scenariuszach badawczych.
1.3.1 Spektrometria mas (MS)
Spektrometria mas to technika powszechnie stosowana w badaniach metabolomicznych z
racji na wysoką czułość, szeroki zakres dynamiczny oraz zdolność do analizy dużej liczby
metabolitów. W spektrometrii mas metabolity w próbce są jonizowane a następnie
rozdzielane na podstawie stosunku masy do ładunku (m/z). Kolejno rozdzielone jony są
wykrywane, a powstałe widma masowe analizowane w celu ich identyfikacji i analizy
ilościowej.
W spektrometrach mas można wyróżnić kilka etapów analizy spektrometrycznej [32].
Pierwszym jest jonizacja gdzie cząsteczki próbki są przekształcane w naładowane
cząsteczki, czyli jony. Często stosowanymi metodami jonizacji są jonizacja w elektrospreju /
jonizacja przez elektrorozpylanie (ESI), desorpcja/jonizacja laserowa (LDI) i jonizacja
elektronowa (EI). Wybór techniki zależy od takich czynników jak polarność, masa
cząsteczkowa i stabilność termiczna cząsteczek próbki. LDI-MS jest techniką najczęściej
używaną do badań metabolomicznych - wykorzystuje laser do desorpcji i jonizacji
cząsteczek z próbki do analizy. Jego główną zaletą jest możliwość badania próbek, których
skuteczność jonizacji jest niska takie jak duże cząsteczki biologiczne. Można ją dostosować
do szerokiego zakresu typów próbek i zwykle wymaga minimalnego przygotowania próbki.
Po zjonizowaniu cząsteczek próbki powstałe jony są wprowadzane do analizatora masy.
Tam następuje ich rozdzielenie na podstawie stosunku masy do ładunku (m/z). Na rynku
dostępne są różne typy analizatorów masy takie jak kwadrupolowy, czasu przelotu (TOF),
pułapka jonowa czy też Orbitrap. Każdy ma unikalne zalety i ograniczenia w zakresie
dokładności masy, zdolności rozdzielczej i szybkości skanowania. W TOF-MS
(Time-of-Flight Mass Spectrometry) jony są przyspieszane do określonej energii kinetycznej i
wprowadzane do analizatora masy, gdzie są rozdzielane na podstawie stosunku masy do
ładunku (m/z). Po rozdzieleniu jonów w analizatorze masy są one wykrywane przez
odpowiedni detektor jak powielacz elektronów lub kubek Faradaya. Detektor generuje sygnał
elektryczny proporcjonalny do liczby trafiających do niego jonów. Sygnały te są następnie
23
przekształcane w widmo masowe które pokazuje intensywność (liczebność) jonów w funkcji
wartości m/z. Na Rycinie 1 przedstawiono przykładowe widmo spektrometryczne z analizy
tkanki nowotworowej raka pęcherza moczowego. Ostatnim etapem jest analiza danych.
Otrzymane widma masowe są analizowane przy użyciu specjalistycznego oprogramowania
w celu identyfikacji i analizy ilościowej metabolitów. Może to obejmować wykrywanie
sygnałów i przeszukiwanie bazy danych w celu dopasowania obserwowanych wartości m/z
wzorów izotopowych i wzorów fragmentacji (dla eksperymentów MS/MS) do znanych
związków. Analiza ilościowa analitów jest zwykle osiągana przez porównanie intensywności
albo powierzchni sygnałów próbki z intensywnością lub powierzchnią wewnętrznych bądź
zewnętrznych wzorców.
Rycina 1. Przykładowe widmo spektrometryczne z analizy tkanki nowotworowej pęcherza
moczowego. Oś pozioma przedstawia stosunek masy (m) do ładunku (z) jonu (m/z). Oś
pionowa przedstawia intensywność (liczba zliczeń danego jonu przez detektor). Sygnały
pochodzą od jonów wytworzonych podczas jonizacji związków.
Kluczowe cechy MS to wysoka czułość co oznacza że może wykrywać metabolity w bardzo
niskich stężeniach, a to szczególnie przydatne w identyfikacji biomarkerów w stężeniach
śladowych. Inną cechą jest szeroki zakres dynamiczny, mianowicie MS może jednocześnie
analizować metabolity w szerokim zakresie stężeń w próbce. Dodatkowo MS cechuje
wszechstronność co oznacza, że może być sprzężony z różnymi technikami separacji,
takimi jak chromatografia cieczowa (LC-MS) lub chromatografia gazowa (GC-MS), w celu
uzyskania rozdziału chromatograficznego metabolitów, co poprawia zdolność i parametry
detekcji oraz identyfikacji złożonych mieszanin metabolitów.
24
1.3.1.1 Obrazowanie MS (Mass Spectrometry Imaging, MSI)
Spektrometria mas wykonywana w instrumentach ze źródłem jonów typu MALDI/SALDI
umożliwia dodatkowo przedstawienie rozkładu powierzchniowego wykrytych związków
próbki stałej (np. tkanki) w formie graficznej, w postaci tzw. obrazowania MS [33].
Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) i desorpcja/jonizacja laserowa
wspomagana powierzchnią (SALDI) to techniki jonizacji stosowane w spektrometrii mas.
Procedura MALDI polega na wykorzystaniu lasera do jonizacji cząsteczek w próbce za
pomocą dodatkowo dodawanej do próbki matrycy. Analizowana próbka jest mieszana z
odpowiednim materiałem matrycy, a następnie naświetlana laserem. Matryca pochłania
energię lasera i pomaga w desorpcji oraz jonizacji cząsteczek próbki. Jony są kolejno
przyspieszane do analizatora masy w celu ich wykrycia. Technika ta nadaje się do analizy
biomolekuł, takich jak białka, peptydy i polimery, ponieważ powoduje niewielką fragmentację
próbki. SALDI jest modyfikacją MALDI, w której zamiast matrycy organicznej do
desorpcji/jonizacji laserowej wykorzystywane są powierzchnie nanostrukturalne.
Nanostrukturalną powierzchnią mogą być nanocząstki metali, nanorurki węglowe lub inne
nanostruktury. Podobnie jak w przypadku MALDI analizowana próbka jest umieszczana na
nanostrukturalnej powierzchni, a promieniowanie laserowe powoduje desorpcję i jonizację
cząsteczek próbki. Ze względu na zastosowanie nanostrukturalnych powierzchni SALDI
często oferuje lepszą odtwarzalność, niższe tło chemiczne na widmie MS i wymaga
mniejszych ilości próbek w porównaniu z MALDI [34].
Metoda obrazowania LDI-MS ma kilka zalet, które czynią ją cennym narzędziem,
szczególnie w dziedzinie badań biomedycznych. Kluczową siłą LDI-MSI jest jej wysoka
rozdzielczość przestrzenna. Pozwala to na graficzne mapowanie rozkładu metabolitów w
próbce tkanki, co jest szczególnie pomocne w badaniach nad nowotworami do identyfikacji
granic guzów i potencjalnych obszarów przerzutów. LDI-MSI charakteryzuje się również
zdolnością do wykrywania szerokiej gamy cząsteczek - od małych metabolitów do większych
białek i polipeptydów. Ten szeroki zakres wykrywalności sprawia, że jest to wszechstronny
instrument do badania złożonych systemów biologicznych. Kolejną zaletą LDI-MSI jest
możliwość jednoczesnego obrazowania wielu cząsteczek w jednym eksperymencie. Ta
zdolność jest szczególnie przydatna przy badaniu skomplikowanych układów biologicznych,
w których wiele cząsteczek może wchodzić w interakcje. Co więcej, LDI-MSI może
dostarczyć danych ilościowych na temat wykrywanych cząsteczek, umożliwiając porównanie
pewnych poziomów molekularnych pomiędzy różnymi próbkami tkanek, takimi jak zdrowe i
nowotworowe. Wreszcie, technika ta może być nieniszcząca dla próbki poprzez
zastosowanie tzw. imprintów - do wykonania analizy tkanki wystarczy tylko odcisk tkanki.
Daje to możliwość przeprowadzenia dalszych analiz lub walidacji przy użyciu innych metod
na tej samej próbce. Na Schemacie 2 przedstawiono przykładowe zastosowanie
obrazowania MS w raku nerki.
Obrazowanie MS może potencjalnie wspomóc w wielu aspektach badanie histopatologiczne.
Prawidłowa identyfikacja pochodzenia guza jest kluczowa dla spersonalizowanego leczenia.
W znacznej liczbie przerzutów nowotworowych, nie udaje się ustalić na podstawie badania
histopatologicznego w połączeniu z metodami immunohistochemicznymi pochodzenia guza
pierwotnego. Meding i wsp. udowodnili, że za pomocą obrazowania MS, można rozróżnić
sześć rodzajów gruczolakoraków (przełyk, pierś, jelito grube, wątroba, żołądek, tarczyca).
25
Udowodnili również, że dzięki niemu możliwe jest rozróżnienie między przerzutami raka jelita
grubego, pierwotnym guzem jelita grubego oraz rakiem wątrobowokomórkowym [30].
Schemat 2. Obrazowanie MS raka jasnokomórkowego nerki i przylegającego zdrowego
miąższu nerki z zastosowaniem metody AuNPET SALDI. Intensywność sygnału w
przypadku związku zidentyfikowanego jako digliceryd (18:1/20:2) jest około 50 razy większa
w rejonie z rakiem w porównaniu ze zdrową tkanką*.
*Nizioł J i wsp. Surface-Transfer Mass Spectrometry Imaging of Renal Tissue on Gold Nanoparticle Enhanced
Target. Anal Chem. 2016;88(14):7365-7371.)
Z uwagi na szybkość badania tkanki przy użyciu technologii obrazowania MS (10-30 min)
oraz brak potrzeby stosowania dodatkowych barwień, markerów i odczynników może mieć
ona zastosowanie w ocenie marginesów chirurgicznych w badaniu śródoperacyjnym. Ocena
marginesu chirurgicznego jest rzadko przeprowadzana śródoperacyjnie ze względu na
ograniczenia czasowe i małą precyzję takiej oceny. Rutynowe, patologiczne badanie
śródoperacyjne nie dostarcza także informacji molekularnych. Pirro i wsp. pokazali, że
obrazowanie MS może być użyteczne w śródoperacyjnej ocenie marginesów chirurgicznych
- w trakcie resekcji glejaka mózgu (czułość 93%), a pomiary molekularne mogą być szybko
wykonywane na tkankach podczas operacji w celu identyfikacji typów tkanek, oceny
naciekania nowotworu oraz identyfikacji obecności mutacji prognostycznych poprzez
oznaczenie onkometabolitów i fosfolipidów [31].
1.3.2 Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)
Spektroskopia NMR jest kolejną techniką stosowaną w badaniach metabolomicznych.
Opiera się na obserwacji zachowania jąder atomowych w polu magnetycznym, co pozwala
na identyfikację oraz analizę ilościową metabolitów na podstawie ich odmiennego otoczenia
chemicznego i częstotliwości rezonansowych [35].
26
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego działa na zasadzie właściwości
magnetycznych niektórych jąder, takich jak wodór-1 czy węgiel-13. Gdy próbka jest
umieszczona w silnym i jednorodnym polu magnetycznym, jądra te ustawiają się zgodnie z
kierunkiem pola magnetycznego, a każde z nich obraca się wokół własnej osi. Przyłożone
pole magnetyczne rozdziela poziomy energetyczne wirujących jąder, tworząc różnicę między
stanem o niższej energii (zgodnym z kierunkiem polem) a stanem o wyższej energii
(niezgodnym z kierunkiem pola). Następnie stosowany jest impuls o częstotliwości radiowej,
który odpowiada luce energetycznej między niższymi i wyższymi stanami energetycznymi.
Energia ta powoduje, że jądra zmieniają swój stan spinowy, pochłaniając energię i
przechodząc do stanu o wyższej energii. Po wyłączeniu impulsu jądra rozluźniają się z
powrotem do pierwotnego stanu spinowego, uwalniając energię, którą wcześniej pochłonęły.
Energia uwalniana podczas relaksacji, w formie fal radiowych, jest wykrywana przez NMR.
Czas potrzebny na relaksację jąder i ilość energii, którą uwalniają, zależą od otoczenia
chemicznego każdego jądra i dostarcza szczegółowych informacji o strukturze cząsteczki.
Spektrometr NMR wykorzystuje te dane do wygenerowania widma, które można
zinterpretować w celu określenia struktury molekularnej próbki. Należy zauważyć, że NMR
jest techniką niedestrukcyjną, co oznacza, że próbkę można odzyskać w niezmienionej
postaci po zakończeniu pomiarów. Technika ta ma szerokie zastosowanie w takich
dziedzinach jak chemia organiczna, chemia medyczna i biochemia. Głównym ograniczeniem
analizy NMR jest niższa czułość w porównaniu z MS, co może utrudniać wykrywanie
metabolitów o niskim stężeniu.
1.3.3 Zalety i wady poszczególnych metod analizy chemicznej
Spektrometria masowa (MS) i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)
są szeroko stosowane w badaniach metabolomicznych, a każda z metod ma swoje zalety i
wady [36,37]. Główną zaletą MS jest wysoka czułość, co oznacza, że może wykryć nawet
niewielkie ilości metabolitów w próbce. Połączenie chromatografii ze spektrometrią lub
zastosowanie nowoczesnych metod jonizacji, tj. MALDI/SALDI, pozwala na oznaczenie
szerszego zakresu metabolitów, które może analizować, w tym polarne, niepolarne i lotne
związki. Analiza metabolomiczna oparta na MS może być stosunkowo szybka, co czyni ją
odpowiednią do badań na dużą skalę i z udziałem wielu próbek.
MS ma jednak pewne wady. Często wymaga złożonego przygotowania próbki, co może
wprowadzić zmienność i potencjalne błędy. Wiele technik MS wymaga wstępnego etapu
separacji chromatograficznej, takiego jak chromatografia gazowa lub chromatografia
cieczowa, a to może być czasochłonne i prowadzić do utraty bądź degradacji próbki.
Obecność innych związków w matrycy próbki może wpływać na jonizację i wykrywanie
metabolitów, powodując tłumienie lub wzmacnianie jonów. Ponadto, aby zidentyfikować i
oznaczyć ilościowo metabolity, MS często wymaga znanych standardów referencyjnych.
Stanowi to pewne ograniczenie, ponieważ nie wszystkie metabolity mają komercyjnie
dostępne standardy.
Spektrometria masowa dostarcza danych o stosunku masy do ładunku (m/z) jonów, które
mogą być wykorzystane do wnioskowania o masie cząsteczkowej i elementach
strukturalnych związku. Jednak różne związki mogą czasami dawać podobne wartości m/z,
co prowadzi do niejednoznaczności. Co więcej, baza danych używana do dopasowywania
może nie być całkowicie wyczerpująca, co za tym idzie - mogą istnieć nieznane związki,
27
które pasują do obserwowanych danych, ale nie są uwzględnione w bazie danych. Aby
jednoznacznie zidentyfikować metabolit, często wymagane są dodatkowe metody
identyfikacji. W tym celu stosowana jest tandemowa spektrometria mas (MS/MS) i/lub
spektrometria mas o wysokiej albo ultrawysokiej rozdzielczości (HRMS). MS/MS dostarcza
informacji strukturalnych o metabolitach, które mogą pomóc w jego identyfikacji, podczas
gdy HRMS zapewnia dokładniejsze wartości m/z, które mogą pomóc zawęzić opcje
identyfikacji. Eksperymenty tandemowe MS (MS/MS) mogą dostarczyć dodatkowych danych
strukturalnych o metabolitach, wspomagając identyfikację i walidację. MS/MS jest
dwuetapowym procesem, który pomaga zidentyfikować cząsteczki w oparciu o dodatkowe
dane strukturalne niż pojedyncza analiza spektrometrii mas. Pierwszy etap jest podobny do
typowego eksperymentu spektrometrii masowej, gdzie cząsteczki są jonizowane i sortowane
na podstawie ich stosunku masy do ładunku. Jednakże, w przeciwieństwie do
jednostopniowej spektrometrii mas, MS/MS na tym nie kończy. Wykorzystuje niektóre z
posortowanych jonów i rozbija je na mniejsze części, czyli fragmenty. Odbywa się to za
pomocą procesu zwanego dysocjacją indukowaną zderzeniem, gdzie jony są przyspieszane
i zderzają się z gazem obojętnym, powodując ich rozpad. Te pofragmentowane jony są
następnie analizowane w drugim etapie procesu MS/MS. Otrzymane widma dostarczają
informacji o strukturze cząsteczek, w tym sekwencji peptydów lub strukturze metabolitu, co
może być cenne dla identyfikacji nieznanych metabolitów albo potwierdzenia identyfikacji
danych metabolitów. Dlatego MS/MS jest szeroko stosowany w badaniach proteomiki i
metabolomiki.
Z drugiej strony, magnetyczny rezonans jądrowy ma swój unikalny zestaw zalet. Dostarcza
szczegółowych informacji strukturalnych o metabolitach, co czyni go doskonałym
narzędziem do identyfikacji i charakterystyki nieznanych związków. NMR pozwala na analizę
ilościową metabolitów bez potrzeby stosowania zewnętrznych lub wewnętrznych wzorców,
ponieważ intensywność sygnału jest wprost proporcjonalna do stężenia analitu. NMR
wymaga zwykle mniej złożonego przygotowania próbki w porównaniu z MS, co zmniejsza
potencjał zmienności i błędu systematycznego. Ponadto NMR jest techniką nieniszczącą, co
pozwala na odzyskanie próbki po analizie w celu dalszego badania lub zastosowania technik
uzupełniających.
Jednakże NMR ma również ograniczenia, np. znacznie niższą czułość w porównaniu z MS,
może nie wykryć metabolitów obecnych w niskich stężeniach [28,29]. W praktyce oznacza to
możliwość oznaczenia w badanej próbce biologicznej zwykle do 100 związków chemicznych
co może utrudniać wykrywanie metabolitów o niskim stężeniu w złożonych próbkach. Dla
porównania MS pozwala na oznaczenie w tych samych próbkach ponad 1000 różnych
związków [29]. NMR jest bardziej odpowiedni do analizy polarnych i nielotnych metabolitów,
podczas gdy jego przydatność do związków niepolarnych i lotnych jest ograniczona.
Nakładające się sygnały w złożonych próbkach biologicznych mogą sprawić, że analiza
spektralna NMR będzie wyzwaniem, szczególnie w przypadku mieszanin zawierających
liczne metabolity. Wysokopolowe spektrometry NMR są drogie w zakupie i wymagają
specjalistycznej konserwacji, a to może ograniczać dostępność dla niektórych laboratoriów.
1.3.4 Analiza danych, identyfikacja metabolitów, mapowanie ścieżek metabolicznych
W badaniach metabolomicznych, analiza danych, identyfikacja metabolitów i wyznaczanie
szlaków metabolicznych to kluczowe kroki do uzyskania wglądu w złożone systemy
28
biologiczne. Różne metody, oprogramowanie i bazy danych zostały opracowane w celu
ułatwienia tych zadań, umożliwiając naukowcom odkrycie cennych informacji biologicznych z
zawiłych danych metabolomicznych [38].
Analiza danych w metabolomice obejmuje kilka etapów, takich jak przetwarzanie wstępne,
normalizacja, skalowanie i analiza statystyczna. Przetwarzanie wstępne obejmuje redukcję
szumów, korekcję linii podstawowej, wykrywanie sygnałów i wyrównanie, podczas gdy
normalizacja danych i skalowanie pomagają uwzględnić różnice w stężeniu próbki lub
odpowiedzi urządzenia. Pozwala to na dokładniejsze porównania pomiędzy różnymi
próbkami albo eksperymentami. Analizy metabolomiczne, a w szczególności niecelowana
analiza metabolomiczna, prowadzą do powstania złożonych zbiorów danych. Dlatego też
stworzono narzędzia analityczne, które są kluczowe dla przetwarzania i interpretacji tych
wyników. Pomagają w rozwiązywaniu problemów z przetwarzaniem dużej ilości danych,
analizami statystycznymi, identyfikacją metabolitów oraz umiejscowieniem ich w
poszczególnych szlakach metabolicznych. Rodzaje analiz statystycznych, które można
zastosować odnośnie do danych metabolomicznych są bardzo obszerne a wybór
właściwego testu może stanowić wyzwanie. Przykłady oprogramowania do analizy danych
obejmują MetaboAnalyst, platformę internetową do kompleksowej analizy, wizualizacji i
interpretacji danych metabolomicznych, czy też oprogramowanie ogólne, np. SIMCA lub
MatLAB.
Po wykryciu metabolitów i porównaniu ich poziomów pomiędzy grupami eksperymentalnymi,
kolejnym krokiem jest identyfikacja konkretnych związków odpowiedzialnych za
obserwowane zmiany. Często wymaga to porównania zmierzonego stosunku masy do
ładunku (m/z), czasu retencji i wzorców fragmentacji (dla danych MS) lub przesunięć
chemicznych i stałych sprzężenia (dla danych NMR) z danymi referencyjnymi dostępnymi w
bibliotekach spektralnych albo bazach danych. Bazy danych do identyfikacji metabolitów
obejmują Human Metabolome Database (HMDB), która oferuje szczegółowe informacje na
temat ludzkich metabolitów, METLIN, bazę danych metabolitów zawierającą widma MS/MS i
inne informacje dla wielu związków, MassBank, publiczne repozytorium danych widm
masowych oraz Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB), bazę danych widm
NMR dla różnych biomolekuł.
Mapowanie zidentyfikowanych metabolitów na szlaki metaboliczne jest kluczowe dla
zrozumienia procesów biologicznych leżących u podstaw obserwowanych zmian. Może to
pomóc w zidentyfikowaniu ścieżek metabolicznych, które uległy zmianie, i wygenerowaniu
hipotez dotyczących mechanizmów napędzających różnice między grupami
eksperymentalnymi. Narzędzia i bazy danych do mapowania ścieżek metabolicznych
obejmują Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), wspomniany MetaboAnalyst
Pathway Analysis, MetScape oraz Reactome.
1.3.5 Analiza statystyczna w badaniach metabolomicznych
Metodologia stosowana do interpretacji danych metabolomicznych zostały zaadaptowane od
powstałych wcześniej analiz genomicznej i transkryptomicznej. Klasyczne podejście
analityczne polega na ocenie różnic grupowych. W tym celu stosuję się analizy
jednozmiennowe i wielozmiennowe [39,40,41]. Jednym z narzędzi wykorzystywanych w
analizie statystycznej danych metabolomicznych jest MetaboAnalyst 5.0 [42]. To
29
kompleksowe narzędzie online do analizy danych metabolomicznych, które integruje szereg
zaawansowanych metod statystycznych i uczenia maszynowego, obejmując wszystkie etapy
analizy danych metabolomicznych. Proces ten zakłada wstępne przetwarzanie i
normalizację danych, eksploracyjną analizę danych oraz interpretację funkcjonalną.
Przetwarzanie i normalizacja danych są kluczowymi krokami wstępnymi, a narzędzie to
oferuje szeroką gamę metod normalizacji, w tym normalizację według sumy, mediany,
skalowania Pareta i automatycznego skalowania. MetaboAnalyst zapewnia odmienne
sposoby wizualizacji danych wielowymiarowych, takie jak analiza głównych składowych,
mapy cieplne i hierarchiczne grupowanie, które mają kluczowe znaczenie dla wstępnej
kontroli danych, identyfikacji wartości odstających i rozróżniania grup. Jeśli chodzi o analizę
statystyczną, obejmuje ono połączenie metod jedno- i wielowymiarowych. Techniki takie jak
testy t, analiza wariancji i volcan plot pomagają w analizie jednowymiarowej, podczas gdy
częściowa analiza dyskryminacyjna metodą najmniejszych kwadratów (PCA) i ortogonalna
częściowa analiza dyskryminacyjna metodą najmniejszych kwadratów (OPLSDA) mogą być
stosowane do analizy wielowymiarowej. Techniki te wspomagają identyfikację najbardziej
dyskryminujących metabolitów, które różnicują odmienne grupy próbek. W przypadku
bardziej złożonych projektów eksperymentalnych narzędzie obejmuje metody statystyczne,
takie jak analiza szeregów czasowych i dwuczynnikowa ANOVA. Jeśli chodzi o uczenie
maszynowe, jest kilka metod, takich jak vector machines, random forests i k-nearest
neighbors, przydatnych do zadań klasyfikacji i przewidywania. W narzędziu tym dostępna
jest również analiza ścieżek i analiza wzbogacenia ścieżek, które przy użyciu
zidentyfikowanych metabolitów mogą podkreślić najistotniejsze szlaki metaboliczne i
zapewnić wgląd w biologiczne mechanizmy stojące za obserwowanymi zmianami w
metabolomie. Wreszcie, narzędzie zapewnia również też walidację modeli i ocenę istotności
statystycznej za pomocą takich metod jak testy permutacyjne czy walidacja krzyżowa.
Jednowymiarowe metody statystyczne
Jednowymiarowe metody statystyczne analizują jedną zmienną jednocześnie i porównują
poziomy każdego metabolitu indywidualnie pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
Przykłady tych metod obejmują test t-Studenta, który porównuje średnie dwóch grup; analiza
wariancji (ANOVA), która porównuje średnie wielu grup. Jeśli ANOVA wykaże znaczące
różnice, przeprowadzane są testy post-hoc w celu określenia, które konkretne grupy różnią
się od siebie. Krotność zmiany (fold-change, FC), która jest stosunkiem średnich poziomów
metabolitów między dwiema grupami eksperymentalnymi. Test U Manna-Whitneya lub test
Kruskala-Wallisa to testy nieparametryczne, które mogą być stosowane, gdy dane nie
spełniają założeń testu t-Studenta ani ANOVA (np. gdy dane nie mają rozkładu normalnego).
WIelowymiarowe analizy statystyczne
Z drugiej strony wielowymiarowe metody statystyczne obejmują równoczesną analizę wielu
zmiennych, biorąc pod uwagę zależności między metabolitami i ogólne wzorce w danych.
Wyróżnia się dwie główne grupy analiz statystycznych stosowanych w metabolomice:
analizy nadzorowane i nienadzorowane.
- Metody nienadzorowane. W analizie statystycznej metody nienadzorowane
koncentrują się na znajdowaniu wzorców, struktur lub związków w danych bez
opierania się na znanych etykietach czy wynikach. Analiza składowych głównych
30
(Principal Component Analysis, PCA) to technika nienadzorowanej analizy, która jest
często stosowana w metabolomice do redukcji wymiarowości danych i wizualizacji
złożoności próbek. PCA identyfikuje główne składowe w danych, które wyjaśniają
największą wariancję. Może być używana do analizy podobieństw i różnic między
próbkami, bez uwzględniania żadnych z góry określonych grup próbek. Pozwala na
zidentyfikowanie wzorców i tendencji w danych metabolomicznych, co może
prowadzić do dalszych analiz i hipotez badawczych.
- Metody nadzorowane. W analizie statystycznej metody nadzorowane wykorzystują
zbiory danych ze znanymi etykietami lub wynikami do budowy modeli, które mogą
przewidzieć etykiety dla nowych, niewidzianych danych. Analiza dyskryminacyjna
oparta na ortogonalnej projekcji do najmniejszych kwadratów (Orthogonal Projection
to Latent Structures Discriminant Analysis, OPLS-DA) to przykład analizy
nadzorowanej, która jest wykorzystywana do identyfikacji metabolitów różniących się
między z góry zdefiniowanymi grupami próbek. OPLS-DA jest rozwinięciem PCA,
które uwzględnia informacje o klasach próbek. Tworzy model dyskryminacyjny
pozwalający na przewidywanie przynależności próbek do określonych grup na
podstawie ich profili metabolomicznych. Może być stosowany do identyfikacji
biomarkerów różnicujących odmienne grupy próbek, np. próbki zdrowych i chorych.
Podsumowując, PCA jest przykładem analizy nienadzorowanej w metabolomice, która służy
do redukcji wymiarowości danych i wizualizacji złożoności próbek. OPLS-DA natomiast jest
przykładem analizy nadzorowanej, która pozwala na identyfikację metabolitów różniących
się między zdefiniowanymi grupami próbek. Zarówno PCA, jak i OPLS-DA są szeroko
stosowane w metabolomice oraz dostarczają cennych informacji na temat wzorców i różnic
w danych metabolomicznych.
Metody uczenia maszynowego
Techniki uczenia maszynowego są wykorzystywane do złożonych zadań, takich jak
przewidywanie wyników lub klasyfikowanie próbek na podstawie zestawu cech, w tym
przypadku metabolitów. Techniki te są szczególnie przydatne, gdy istnieje wiele zmiennych
(tj. metabolitów) i zachodzą między nimi złożone relacje [43].
- Maszyny wektorów nośnych (support vector machines, SVM): popularna metoda
uczenia maszynowego stosowana zarówno do klasyfikacji, jak i regresji. W
metabolomice SVM może być wykorzystywana do rozróżniania odmiennych klas
próbek (np. choroba vs. kontrola) na podstawie ich profili metabolitów. Główną ideą
SVM jest znalezienie hiperpłaszczyzny, która najlepiej oddziela klasy, jednocześnie
maksymalizując margines między najbliższymi próbkami każdej klasy (wektory
wsparcia).
- Lasy losowe (random forest, RF): to wszechstronna metoda wykorzystująca zespół
drzew decyzyjnych. Każde drzewo jest budowane przy użyciu próbki bootstrapowej
danych, a ostateczna prognoza opiera się na większości głosów (w przypadku
klasyfikacji) lub średniej (w przypadku regresji) wszystkich drzew [44]. Bootstrap to
technika statystyczna polegająca na tworzeniu nowych próbek z istniejącego zbioru
danych poprzez losowe wybieranie punktów danych z szansą na wielokrotne
wybranie tego samego punktu danych. Lasy losowe mogą uchwycić złożone,
nieliniowe zależności między zmiennymi, a także zapewniają miarę ważności
31
zmiennej, którą można wykorzystać do identyfikacji najbardziej wpływowych
metabolitów.
- Algorytm k-najbliższych sąsiadów (k-nearest neighbours, KNN): prosta, ale
skuteczną metodą klasyfikacji i regresji. W przypadku klasyfikacji w metabolomice
próbka jest klasyfikowana na podstawie klasy większościowej jej k najbliższych
sąsiadów w przestrzeni metabolitów.
- Uczenie głębokie (deep learning): algorytmy głębokiego uczenia, w szczególności
sztuczne sieci neuronowe (ANN), są coraz częściej wykorzystywane do analizy
danych metabolomicznych. Składają się z warstw połączonych węzłów lub
"neuronów" i mogą modelować złożone, nieliniowe zależności. Konwolucyjne sieci
neuronowe (CNN) i rekurencyjne sieci neuronowe (RNN) to inne formy modeli
głębokiego uczenia wykorzystywane w konkretnych zastosowaniach.
Słownik pojęć statystycznych stosowanych w publikacjach
PCA (Principal Component Analysis - analiza głównych składowych) to technika
statystyczna używana do redukcji wymiarowości danych. Często sięga się po nią w celu
uproszczenia złożonych zestawów danych, jednocześnie starając się zachować jak
najwięcej informacji zawartych w tych danych. PCA przekształca oryginalne zmienne,
które mogą być ze sobą skorelowane, w nowe, niezależne "główne składowe". Pierwsza
główna składowa (PCA1) wyjaśnia najwięcej zmienności w danych, a każda kolejna
główna składowa (PCA2) wyjaśnia jak najwięcej pozostałej zmienności, będąc
jednocześnie ortogonalną (prostopadłą) do poprzednich składowych. PCA jest używana
do wizualizacji ogólnej struktury danych, identyfikacji grup lub klastrów oraz wykrywania
obserwacji odstających (outlierów).
OPLS-DA (Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis - ortogonalna
analiza dyskryminacyjna częściowych najmniejszych kwadratów) to metoda
statystyczna używana do budowy modeli predykcyjnych dla danych z góry zdefiniowanych
klas (np. zdrowy vs. chory). To nadzorowana metoda, która różni się od PCA tym, że nie
tylko redukuje wymiarowość danych, lecz także maksymalizuje różnice między
zdefiniowanymi klasami. Metoda ta jest często używana w metabolomice, gdy interesuje
nas zidentyfikowanie metabolitów różniących się pomiędzy grupami. OPLS-DA separuje
zmienność w danych, która jest bezpośrednio powiązana z wynikiem zainteresowania
(tzw. zmienność predyktywną), od zmienności, która nie jest z tym wynikiem związana
(tzw. zmienność ortogonalna). Dzięki temu łatwiej identyfikować metabolity, które są
istotne w różnicowaniu grup.
Korekta Bonferroniego i współczynnik fałszywych odkryć (FDR) to techniki
statystyczne służące do korekty porównań wielokrotnych. Biorąc pod uwagę, że badanie
metabolomiczne może przeprowadzać testy na tysiącach metabolitów jednocześnie,
kontrolowanie odsetka wyników fałszywie dodatnich ma kluczowe znaczenie.
Korekta Bonferroniego to metoda w której poziom istotności jest dzielony przez liczbę
porównań (np. w przypadku testowania 20 metabolitów, wynik uznany będzie za istotny,
gdy wartość p jest niższa niż 0,05/20 = 0,0025). Może być jednak zbyt rygorystyczna w
32
sytuacjach, w których przeprowadzanych jest wiele testów, co prowadzi do wysokiego
wskaźnika wyników fałszywie ujemnych.
Współczynnik fałszywych odkryć (FDR) to mniej rygorystyczna metoda niż korekta
Bonferroniego i często stosowana podczas przeprowadzania dużej liczby testów.
Kontroluje oczekiwany odsetek nieprawidłowo odrzuconych hipotez zerowych (fałszywych
odkryć). Procedura Benjamini-Hochberg jest powszechnie stosowaną metodą kontroli
FDR.
VIP (Variable Influence on Projection - wpływ zmiennej na projekcję) to parametr
statystyczny używany w analizie wielowymiarowej, takich jak regresja cząstkowa
najmniejszych kwadratów (PLS) i ortogonalna regresja cząstkowa najmniejszych
kwadratów (OPLS). VIP mierzy znaczenie każdej zmiennej (w tym przypadku metabolitu)
w projekcji lub rozróżnianiu między odmiennymi grupami albo klasami. Określa wkład
każdej zmiennej w model predykcyjny. Zmienne o wyższych wartościach VIP są uważane
za mające większy wpływ na model i są bardziej istotne w rozróżnieniu między grupami.
W kontekście studiów metabolomicznych lub innych studiów omicznych, wartości VIP
często są używane do wyboru istotnych zmiennych bądź biomarkerów, które znacząco
przyczyniają się do separacji lub klasyfikacji różnych grup próbek (np. tkanka
nowotworowa vs. zdrowa). Połączenie wartości VIP z innymi miarami statystycznymi,
takimi jak analiza współczynnika zmiany, FC (fold change) i test t, pozwala na
zidentyfikowanie metabolitów, które wykazują istotne różnice między grupami i mają
potencjalną wartość diagnostyczną lub predykcyjną.
R2Y i Q2 oraz test permutacji - to parametry statystyczne stosowane przy walidacji
modeli wielowymiarowych, takich jak te generowane ortogonalną analizę dyskryminacyjną
najmniejszych kwadratów częściowych (OPLS-DA).
R2Y: parametr często określy się jako "dopasowanie modelu". Reprezentuje proporcję
wariancji zmiennej odpowiedzi (Y), którą można wyjaśnić za pomocą modelu. Jest to
miara, jak dobrze model pasuje do zaobserwowanych danych. Wartość R2Y wynosząca 1
wskazuje na doskonałe dopasowanie, natomiast wartość bliżej 0 wskazuje na słabe
dopasowanie.
Q2: miara "zdolności predykcyjnej" modelu. Oblicza się ją za pomocą metod walidacji
krzyżowej i szacuje, jak dobrze model może przewidzieć nowe dane. Wartość Q2 bliżej 1
wskazuje na doskonałą zdolność predykcyjną, podczas gdy wartość bliżej 0 sugeruje
słabą zdolność predykcyjną. Ujemna wartość Q2 może sygnalizować nadmierne
dopasowanie modelu, co oznacza, że model może opisywać szum zamiast bazowy trend.
Test permutacji: technika statystyczna, która polega na przetasowaniu, czyli losowym
przestawieniu danych, a następnie porównaniu przetasowanych danych z tymi
oryginalnymi. Celem jest ustalenie, czy obserwowany efekt jest istotny, czy może wynika
po prostu z losowości. Gdy wykonujemy test permutacji z 2000 powtórzeniami,
przetasowujemy dane 2000 razy, za każdym razem obliczając interesującą nas statystykę
(np. różnicę średnich). Każde przetasowanie daje jedno "symulowane" wyniki. Wyniki tych
2000 symulacji tworzą rozkład statystyki testowej pod hipotezą zerową (tj. hipotezą, że
33
obserwowany efekt jest wynikiem losowości). Możemy teraz porównać naszą rzeczywistą
obserwację (statystykę obliczoną na oryginalnych, nieprzetasowanych danych) z tym
rozkładem. Jeżeli rzeczywista obserwacja jest ekstremalna z rozkładem z symulacji (np.
jest w najmniejszym 5% lub największym 5% wyników), to należy odrzucić hipotezę
zerową i uznać, że obserwowany efekt jest statystycznie istotny.
FC (Fold change - współczynnik zmiany) to wskaźnik używany do porównywania
poziomu metabolitów między dwiema różnymi grupami próbek. Odnosi się do wielkości
zmiany w stężeniu metabolitów między tymi grupami. Jest obliczany jako stosunek
średniego stężenia metabolitu w jednej grupie do średniego stężenia w drugiej. Wartość
fold change wyraża ilekroć stężenie metabolitu wzrasta lub maleje między grupami. Na
przykład, fold change wynoszący 2 oznacza, że stężenie metabolitu jest dwukrotnie
większe w jednej grupie w porównaniu z drugą.
Modelowanie random forest to popularny algorytm uczenia maszynowego, który należy
do kategorii metod uczenia zespołowego. Nazwa pochodzi od lasu drzew decyzyjnych
generowanych losowo, które łączą swoje wyniki, aby dokonać predykcji. Można to
porównać z komitetem ekspertów, gdzie każde drzewo decyzyjne to jeden ekspert. Każdy
ekspert (drzewo) wydaje swoją opinię (prognozę), a następnie decyzja komitetu (lasu) jest
podejmowana na podstawie najczęściej występującej opinii (głosowania
większościowego). Etapy modelowania:
1. Tworzenie drzew decyzyjnych: random forest tworzy wiele drzew decyzyjnych,
każde z nich trenowane na różnych podzbiorach danych. To jakby mieć różnych
ekspertów specjalizujących się w różnych obszarach.
2. Prognozowanie: kiedy mamy nowe dane do prognozowania, każde drzewo
decyzyjne (ekspert) dokonuje swojej prognozy.
3. Głosowanie: wszystkie prognozy zostają zebrane i najczęściej występująca staje
się prognozą random forest. To jakby zbierać opinie wszystkich ekspertów, a
potem decydować, idąc za najpopularniejszą z nich.
ROC (Receiver Operating Characteristic - krzywa charakterystyki operacyjnej
odbiornika) to wykres przedstawiający zależność między czułością (True Positive Rate) a
1-swoistością (False Positive Rate) w różnych punktach odcięcia dla danego modelu
diagnostycznego. ROC jest szeroko stosowana w analizie diagnostycznej i ocenie
skuteczności modeli klasyfikacyjnych.
AUC (Area Under the Curve - obszar pod krzywą to parametr który ocenia zdolność
modelu do rozróżnienia między dwiema klasami lub grupami. Mierzy powierzchnię pod
krzywą ROC. Im większa wartość AUC, tym lepsza zdolność modelu do rozróżnienia
między klasami. AUC równa 1 oznacza doskonałą zdolność rozróżniania, AUC równa 0,5
wskazuje na brak zdolności rozróżniania, a AUC poniżej 0,5 sugeruje
przeciwną interpretację klasyfikacji.
Krzywa ROC i AUC są często stosowane w badaniach diagnostycznych, aby ocenić
skuteczność modeli w rozpoznawaniu choroby. Są szczególnie przydatne, gdy modele
generują wyniki binarne, takie jak choroba/niechoroba. Krzywa ROC i AUC dostarczają
informacji o czułości i swoistości modelu oraz pozwalają na wybór optymalnego punktu
34
odcięcia, który zapewnia równowagę między tymi dwoma wskaźnikami. W badaniach
metabolomicznych, ROC i AUC używane są w analizie biomarkerów. Oceniają
skuteczność różnych metabolitów jako biomarkerów różnicujących tkankę nowotworową
od tkanki zdrowej. AUC wykorzystuje się do określenia efektywności diagnostycznej tych
metabolitów. Metabolity o wyższych wartościach AUC są uważane za bardziej obiecujące
ze względu na lepsze rozróżnianie między grupami próbek nowotworowych i zdrowych.
35
Rozdział 2: Założenia i cel pracy
Założenia leżące u podstaw tej rozprawy obejmują przekonanie, że profil metaboliczny
pacjentów z rakiem pęcherza moczowego wyraźnie różni się od profilu osób zdrowych.
Zakłada się, że różnica ta może być wykryta w surowicy, tkance i moczu przy użyciu
zaawansowanych technik analizy metabolomicznej. Uznano, że metody analizy chemicznej
takie jak NMR i MS w połączeniu z rozbudowanymi narzędziami bioinformatycznymi oraz
metodami analizy statystycznej pozwolą na wykrycie takich związków. Rozprawa zakłada, że
wszelkie zidentyfikowane biomarkery mogą być stosowane jako wiarygodne wskaźniki do
diagnozowania, prognozowania i monitorowania terapeutycznego raka pęcherza
moczowego. Przyjmuje się również, że badana grupa chorych reprezentuje szerszą grupę
demograficzną osób z rakiem pęcherza moczowego, co zapewnia szerokie zastosowanie
wyników badań. Ponadto zakłada się, że metodologie i techniki zastosowane w badaniu, w
oparciu o współczynniki statystyczne przyniosą dokładne i wiarygodne wyniki.
Rozprawa doktorska ma na celu wykorzystanie analizy metabolomicznej surowicy, tkanki i
moczu do wskazania potencjalnych biomarkerów raka pęcherza moczowego. Poprzez
analizę profili metabolicznych i porównanie pacjentów z rakiem pęcherza moczowego i osób
zdrowych, badanie ma ujawnić określone metabolity lub szlaki metaboliczne, które mogłyby
działać jako wczesne markery diagnostyczne, czynniki ryzyka albo cele terapeutyczne.
Badania mają na celu poszerzenie istniejącej wiedzy na temat raka pęcherza moczowego i
utorowanie drogi do bardziej precyzyjnych i mniej inwazyjnych metod diagnostycznych oraz
ukierunkowanych opcji leczenia. Ostatecznym celem jest poprawa wyników leczenia
pacjentów, zmniejszenie obciążenia chorobą i poprawa jakości życia osób, u których
zdiagnozowano raka pęcherza moczowego.
Cele główne:
1. Analiza metabolomiczna tkanki, surowicy i moczu z zastosowaniem spektrometrii mas
oraz spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego.
2. Identyfikacja pojedynczych metabolitów (biomarkerów) i/lub grup metabolitów które będą
rozróżniać pomiędzy tkanką, surowicą oraz moczem nowotworowym i kontrolnym.
3. Ocena analitycznej wiarygodności wykrytych biomarkerów. Będzie się ona opierać na
wielowymiarowej analizie statystycznej z zastosowaniem metod takich jak PCA i OPLS-DA
oraz parametrach statystycznych takich jak: czułość, swoistość, AUC, FC i VIP, dla
poszczególnych związków i grup związków.
Cele poboczne:
1. Identyfikacja szlaków metabolicznych w których występują zidentyfikowane metabolity.
2. Próba zidentyfikowania metabolitów różnicujących poszczególne stopnie zaawansowania
klinicznego oraz stopnie złośliwości histopatologicznej.
3. Ustalenie czy metoda obrazowania MS (LDI-MSI) może wspomóc badanie
histopatologiczne w postawieniu prawidłowej diagnozy w trudnych przypadkach oraz w
wspomagać w wyznaczaniu marginesów resekcji guza nowotworowego.
Cele planuje się osiągnąć poprzez:
1. Zastosowanie nie-celowanej i celowanej analizy metabolomicznej tkanki, surowicy i
moczu pobranych od grupy 100 pacjentów z rakiem pęcherza moczowego oraz 100 osób
36
zdrowych, z zastosowaniem spektrometrii mas oraz spektroskopii magnetycznego
rezonansu jądrowego.
2. Obrazowanie tkanki nowotworowej i zdrowej metodą LDI MSI.
3. Zastosowanie chemometrycznych metod analizy danych do identyfikacji statystycznie
istotnych metabolitów/biomarkerów różnicujących próbki pochodzące od osób z rakiem
pęcherza moczowego z próbkami kontrolnymi, planowane jest zastosowanie internetowych
narzędzi, tj. MetaboAnalyst 4.0 i/lub XCMS Online do analizy statystycznej uzyskanych
wyników: zarówno podstawowej analizy jednozmiennowej (np. za pomocą testu t-Studenta),
jak i analiz wielozmiennowych, tj. analiza głównych składowych - PCA (Principal Component
Analysis) oraz dyskryminacyjny wariant metody cząstkowych najmniejszych kwadratów -
PLS-DA (Partial Least Squares Discriminant Analysis).
4. Analizy szlaków metabolicznych związanych z nowymi markerami.
37
Rozdział 3: Materiały i metody
3.1 Protokół badania, przygotowanie materiału
Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Bioetyczną przy Uniwersytecie
Rzeszowskim (pozwolenie nr 2018/04/10) i przeprowadzony zgodnie z odpowiednimi
wytycznymi i przepisami, m.in. Deklaracją helsińską z 1964 roku i jej późniejszymi zmianami.
Próbki i dane kliniczne od pacjentów biorących udział w badaniu zostały pobrane za
pisemną zgodą.
Do badań metabolomicznych raka pęcherza moczowego zgromadzono fragmenty tkanek,
próbek surowicy i moczu od 100 pacjentów z rakiem pęcherza moczowego oraz 100
kontrolnych próbek surowicy i moczu. Tkanki kontrolne stanowiły fragmenty zdrowej
śluzówki pęcherza moczowego pobrane w trakcie zabiegu TURBT od pacjentów z rakiem
pęcherza moczowego. Od każdego pacjenta pobrano zarówno fragment tkanki
nowotworowej jak i fragment zdrowej śluzówki pęcherza moczowego, każda o wymiarach
około 6 x 6 mm (ok. 5 mg). Celem weryfikacji histopatologicznej preparatów (zarówno
nowotworowej, jak i kontrolnej - prawidłowej) podzielono je na dwie części - jedna została
poddana badaniu histopatologicznemu a drugą zamrożono w temperaturze -60°C. Mocze i
surowice kontrolne pochodzą od pacjentów przyjętych na oddział urologii celem wykonania
diagnostyki lub leczenia zabiegowego łagodnych schorzeń w obrębie układu moczowego, tj.
przerost prostaty, zwężenie cewki moczowej i zwężenie podmiedniczkowe moczowodu,
stulejka, wodniak jądra, żylaki powrózka nasiennego, nietrzymanie moczu i inne. Każdy
pacjent z grupy kontrolnej miał wykonany w ramach hospitalizacji podstawowy pakiet badań
laboratoryjnych (w tym badanie ogólne moczu) i obrazowych (USG jamy brzusznej).
Stanowiło to podstawę do wykluczenia raka pęcherza moczowego w grupie kontrolnej. U
każdego pacjenta, do badania pobrano około 2.6ml krwi oraz 50 ml moczu. Krew była
odwirowana przy 3000 obr/min przez 10 minut w temperaturze pokojowej celem uzyskania
surowicy. Po odwirowaniu oddzieloną surowicę i mocz zamrożono w temperaturze -60°C.
Poszczególne etapy przygotowania tkanki, surowicy i moczu do badania z zastosowaniem
spektrometrii mas lub spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego przedstawiono ze
szczegółami w publikacjach.
38
Rozdział 4: Wyniki i dyskusja
4.1 Analiza metabolomiczna tkanki
Monoisotopic silver nanoparticles-based mass spectrometry imaging of human
bladder cancer tissue: Biomarker discovery,Advances in Medical Sciences, 2023,
K. Ossoliński, T. Ruman, T. Ossoliński, A. Ossolińska, A. Arendowski, A. Kołodziej, A.
Płaza-Altamer, J. Nizioł
W publikacji przedstawiono metabolomiczną analizę tkanki nowotworowej pęcherza
moczowego w porównaniu z tkanką prawidłową. Zastosowano metodę obrazowania
LDI-MSI (obrazowanie metodą laserowej desorpcji/jonizacyjnej spektrometrii mas) opartą na
nanocząstkach srebra (109AgNPET) oraz LDI-MS i MS/MS do analizy ekstraktów
tkankowych. Łącznie przeanalizowano materiał pochodzący od 6 pacjentów (pary tkanka
nowotworowa i zdrowa). Analiza danych MSI doprowadziła do identyfikacji 28 związków,
które wykazywały największe zróżnicowanie między obszarami tkanki nowotworowej i
kontrolnej. Wśród nich 2 związki miały wyższą średnią intensywność w tkance
nowotworowej, podczas gdy pozostałe 26 wykazywało wyższą intensywność w prawidłowej
tkance pęcherza moczowego. Wybrane zostały tylko te związki, które wykazywały spójne
trendy we wszystkich 6 eksperymentach.
Dane dotyczące różnic w intensywności zidentyfikowanych związków poddawano
wielowymiarowej analizie statystycznej w tym analizie głównych składowych (PCA) i
ortogonalnej analizie dyskryminacyjnej metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA), w celu
oceny separacji między obszarami nowotworowymi i normalnymi tkankami. Poprzez
połączenie VIP (>1) z wynikami testu t (wartość p i FDR z testu t <0,05) oraz fold change
(0,5 < FC > 1,2), wybrano 10 metabolitów różnicujących próbki tkanki nowotworowej i
prawidłowej. Metabolity te obejmowały glicynę, hipotaurynę, 3-metylobutanal, etylofosforan,
glutaminę, myosminę, PI(22:0/0:0), aminopentanal, betainę proliny i metyloguanidynę.
Dokładność diagnostyczną wybranych metabolitów oceniono za pomocą analizy krzywej
ROC. Obszary pod krzywymi (AUC) zostały obliczone w celu określenia skuteczności
diagnostycznej metabolitów. Analizy ROC wykazały, że wszystkie wybrane metabolity miały
wartości AUC powyżej 0,81, przy czym hipotauryna i 3-metylobutanal wykazywały
najwyższą wartość AUC = 0,94. Połączenie 10 wybranych metabolitów okazało się lepszym
narzędziem diagnostycznym (AUC = 0,993) niż każdy z metabolitów oddzielnie.
39
4.2 Analiza metabolomiczna surowicy
Untargeted ultra-high-resolution mass spectrometry metabolomic profiling of blood
serum in bladder cancer. Scientific Reports, 2022
J. Nizioł, K. Ossoliński, A. Płaza-Altamer, A. Kołodziej, A. Ossolińska, T. Ossoliński, T.
Ruman
Badanie miało na celu identyfikację potencjalnych biomarkerów raka pęcherza moczowego
w surowicy. W niecelowanym badaniu wykorzystano spektrometrię masową o ultrawysokiej
rozdzielczości (UHRMS) i ultra wysokosprawną chromatografię cieczową (UHPLC) w
ekstraktach surowicach od 100 pacjentów z rakiem pęcherza moczowego (BC) i 100 osób z
grupy kontrolnej (NC) z uwzględnieniem stopnia zaawansowania klinicznego i złośliwości
histopatologicznej. Surowice zostały podzielone na dwie grupy: zestaw treningowy
obejmujący 80% wszystkich próbek i zestaw walidacyjny obejmujący pozostałe 20% próbek.
Profilowanie metaboliczne surowicy przeprowadzono niezależnie na dwóch zestawach
danych. Zbiór treningowy został wykorzystany do identyfikacji markerów diagnostycznych w
surowicy. Zbiór walidacyjny posłużył do niezależnej walidacji skuteczności diagnostycznej
biomarkerów.
Analiza UHPLC-UHRMS wykazała łącznie 5498 wartości m/z (metabolitów) w treningowym i
walidacyjnym zbiorze danych. Analiza PCA wykazała dobrą separację między surowicami
bazując na ich różnych profilach metabolitów. Nadzorowana analiza statystyczna z
wykorzystaniem OPLS-DA dodatkowo podkreśliła różnice metaboliczne między grupami BC
i NC. Na podstawie wartości VIP (>1) z modelu OPLS-DA i niezależnych testów t (wartość p
i FDR <0,05), zidentyfikowano 1012 zmiennych w zbiorze treningowym i 1052 w zbiorze
walidacyjnym, które uznano za statystycznie istotne. Następnie wyselekcjonowano wspólny
zestaw 864 wartości m/z, 121 wartości m/z przyporządkowano określonym związkom
chemicznym. 85 spośród 121 wybranych metabolitów wykazywało wysokie wartości AUC
(>0,8), co wskazuje na dobrą zdolność dyskryminacyjną między próbkami surowicy
nowotworowej i kontrolnej. Analiza AUC dla kombinacji wykrytych metabolitów okazała się
znakomitym dyskryminatorem próbek surowicy BC vs. NC (AUC >0. 99). Ostatecznie
wybrano 27 metabolitów na podstawie wartości odcięcia FC wynoszących >2 i <0,5.
Aby określić, czy analiza metabolomiczna próbek surowicy może pomóc w rozróżnieniu
między różnymi stopniami złośliwości histopatologicznej, przeprowadzono kolejną serię
analiz PCA i OPLS-DA na grupie treningowej (80 NC, 32 pacjentów z HG i 45 pacjentów z
LG) i walidacyjnej (20 NC, 8 pacjentów z HG i 12 pacjentów z LG). Pacjentów z PUNLMP
wykluczono z analizy. Analiza wykazała dobrą dyskryminację między grupami kontrolnymi i
nowotworowymi z rozróżnieniem na raka low-grade (LG) i high grade (HG) zarówno w
zestawach treningowych, jak i walidacyjnych. Modele nie były jednak w stanie w
statystycznie istotny sposób odróżnić surowice pochodzących od pacjentów z
nowotworami LG vs HG. Zidentyfikowano znaczną liczbę wartości m/z , które w isotny
statystycznie sposób rozróżniały pomiędzy poszczególnymi stopniami złośliwości
histopatologicznej a grupą kontrolną (1500 dla HG BC vs. NC i 1600 dla LG BC vs NC). 138
i 148 wartości m/z dla grup HG BC vs. NC i LG BC vs. NC zostało powiązanych z
40
określonymi związkami chemicznymi. Ponadto analizy krzywej ROC wykazały dobrą
wydajność diagnostyczną modeli, przy wartościach AUC >0,75 dla pięciu metabolitów, co
wskazuje na wysoki poziom dokładności. Ostatecznie wyselekcjonowano 23 potencjalne
biomarkery dla podgrup LG i HG BC z wartościami FC >2 i <0,5.
W badaniu przeprowadzono także analizę surowicy w zależności od stopnia zaawansowania
klinicznego. Stadia obejmowały nieinwazyjnego raka brodawczakowatego (pTa), raka
naciekającego podnabłonkową tkankę łączną (pT1) i raka naciekającego błonę mięśniową
(pT2), z łącznie 69 próbkami dla pTa, 19 dla pT1 i 12 dla pT2. Wyniki analizy głównych
składowych (PCA) i ortogonalnej analizy dyskryminacyjnej metodą najmniejszych kwadratów
(OPLS-DA) wykazały dobrą separację między kontrolnymi surowicami (NC) a
poszczególnymi stadiami BC. Nie stwierdzono jednak statystycznie istotnych różnic
przy analizie porównawczej trzech grup stadiów raka względem siebie (pTa vs. pT1 vs.
pT2). Dalsza analiza modelu OPLS-DA, obejmująca analizę FC i VIP, ujawniła szereg
wartości m/z najbardziej istotnych w rozróżnieniu próbek. Obejmowały one 63 wartości m/z
dla pTa BC vs NCs, 66 wartości m/z dla pT1 BC vs. NCs i 69 wartości m/z dla pT2 BC vs.
NCs. Analiza krzywej ROC pozwoliła na zidentyfikowanie 37 potencjalnych biomarkerów z
wartościami FC >2 i <0,5, czułością i swoistością wynoszącą odpowiednio 74% i 62%.
Metabolomic and elemental profiling of blood serum in bladder cancer. Journal of
Pharmaceutical Analysis, 2022
K. Ossoliński, T. Ruman, V. Copié, B.P. Tripet, L. B. Nogueira, K.O.P.C. Nogueira, A.
Kołodziej, A. Płaza-Altamer, A. Ossolińska, T. Ossoliński, J. Nizioł
Badanie dotyczyło analizy 200 próbek surowicy uzyskanych od 100 pacjentów z rakiem
pęcherza moczowego (BC) i 100 zdrowych osób (NC), z wykorzystaniem celowanego i
niecelowanego podejścia profilowania metabolomicznego. Zastosowane techniki analityczne
obejmowały wysokiej rozdzielczości 1H NMR, spektrometria atomowa emisyjna z indukcyjnie
sprzężoną plazmą (ICP-OES) i wysokiej rozdzielczości laserową desorpcję/jonizację MS
(LDI-MS) opartą na nanocząstkach złota i srebra (PFL-2D GS LASiS AuNPs LDI-MS oraz
PFL-2D GS LASiS 109AgNPs LDI-MS).
ICP-OES (Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy - spektrometria
emisyjna z indukcyjnie sprzężonym plazmą) to technika analityczna stosowana do analizy
składu pierwiastkowego próbek [45]. Jest to metoda spektroskopii emisyjnej, która
wykorzystuje zjawisko jonizacji w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP) oraz pomiar emisji
światła przez jonizowane pierwiastki. Próbka wprowadzana jest do indukcyjnie sprzężonej
plazmy w postaci aerozolu. Wysoka temperatura plazmy powoduje rozpad próbki na
atomy składowe, które następnie zostają wzbudzone i emitują światło o
charakterystycznych długościach fal. Mierząc intensywność tego światła, można określić
stężenie pierwiastków w próbce. W kontekście metabolomiki, a dokładnie elementomiki,
ICP-OES może być szczególnie przydatna do wykrywania i ilościowego oznaczania jonów
metali i innych pierwiastków zaangażowanych w różne procesy biochemiczne.
41
PFL-2D GS LASiS to udoskonalona metoda generowania nanocząstek opracowana przez
zespół T. Rumana polegająca na zastosowaniu do generowania nanocząstek lasera
światłowodowego z galwoskanerem 2D która jest połączona jest z laserową
jonizacją/desorpcją wspomaganą nanocząstkami złota (AuNPs) i srebra (109AgNPs).
Surowice zostały podzielone na dwie grupy: zestaw treningowy obejmujący 80% wszystkich
próbek (n=80) i zestaw walidacyjny obejmujący pozostałe 20% próbek (n=20). Profilowanie
metaboliczne surowicy przeprowadzono niezależnie na obu zestawach danych. Zbiór
treningowy został wykorzystany do identyfikacji markerów diagnostycznych w surowicy.
Zbiór walidacyjny posłużył niezależnej walidacji skuteczności diagnostycznej biomarkerów.
200 ekstraktów surowicy (100 od pacjentów z rakiem i 100 z grupy kontrolnej) poddanych
zostało analizie NMR, identyfikując 39 różnych związków w każdej próbce. Dwa metabolity,
3-hydroksymaślan i octan, wykazywały statystycznie znaczące różnice w stężeniu między
grupą chorych na raka i grupą kontrolną. Poziomy 3-hydroksymaślanu były znacznie wyższe
u pacjentów z rakiem, podczas gdy poziomy octanu były zauważalnie niższe. Następnie,
zebrane dane dotyczące metabolitów zostały podzielone na dwie grupy: treningowy zbiór
danych (80 pacjentów z rakiem i 80 kontroli) - w celu opracowania modelu oraz walidacyjny
zbiór danych (20 pacjentów z rakiem i 20 kontroli) - w celu oceny wydajności modelu.
Analiza głównych składowych (PCA) wykazała dobrą separację między grupami
nowotworowymi i kontrolnymi w obu zestawach danych. Następnie zastosowano analizę
OPLS-DA celem szkolenia modelu na zidentyfikowanych metabolitach. Model wykazał silną
separację między grupami nowotworowymi i kontrolnymi. Dalsza analiza modelu OPLS-DA
ujawniła szereg metabolitów o istotnej korelacji z separacją grup. Metabolity, takie jak octan,
propionian, piroglutaminian i cholina, wykazywały dodatnie korelacje, podczas gdy
izomaślan - ujemną. W zestawie walidacyjnym wszystkie metabolity poza piroglutaminianem
wykazały istotność w zdolności do rozróżniania między grupami. Następnie przeprowadzono
analizę krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) na zestawach treningowych i
walidacyjnych w celu oceny potencjału diagnostycznego wybranych metabolitów. Wszystkie
cztery metabolity (octan, propionian, cholina i izomaślan) wykazywały wysokie wartości AUC
(>0,82), przy czym izomaślan okazał się najbardziej znaczącym biomarkerem, uzyskując
najwyższe wyniki w zakresie AUC (>0,953), swoistości (0,9) i czułości (0,9). Następnie
skonstruowano model klasyfikacji ROC, zbudowany przy użyciu MetaboAnalyst 5.0 oparty
na algorytmie random forest. Podejście to obejmowało połączone poziomy tych czterech
metabolitów, okazując się lepszym dyskryminatorem (z AUC >0,999) niż każdy metabolit
osobno.
W celu ustalenia czy analiza metabolomiczna NMR może rozróżnić surowice z
pochodzącymi od pacjentów z nowotworami z różnymi stopniami złośliwości
histopatologicznej, przeprowadzono analizy PCA i OPLS-DA na całym zbiorze danych
metabolitów. Analiza obejmowała 95 próbek surowicy od pacjentów z rakiem pęcherza
moczowego; wykluczono 3 próbki od pacjentów z PUNLMP i 2 próbki od pacjentów z guzem
mieszanym HG + LG. Ostatecznie wykorzystano 41 ekstraktów surowicy od pacjentów z
rakiem HG i 54 próbki od pacjentów z rakiem LG. Zarówno analiza PCA jak i OPLS-DA
wykazały niewielką, ale statystycznie istotną separację pomiędzy grupami LG vs. HG.
Następnie zidentyfikowano 15 następujących metabolitów przyczyniających się do tej
niewielkiej separacji: leucyna, histydyna, alanina, 3-metylo-2-oksowalerianian, tyrozyna,
42
fenyloalanina, cholina, tryptofan, hipoksantyna, asparagina, walina, prolina, treonina,
2-hydroksymaślan i glutamina. Dalsza analiza ROC dla każdego metabolitu z osobna
pozwoliła na selekcję 5 (leucyna, histydyna, alanina, 3-metylo-2-oksowalerianian i tyrozyna)
o wartościach AUC większej niż 0,74. Następnie wyliczono AUC dla modelu opartego na
połączeniu 5 wyselekcjonowanych metabolitów, które wynosiło 0,775.
Przeanalizowano również różnicę w profilach metabolicznych w zależności od stopnia
zaawansowania klinicznego z zastosowaniem NMR. Uwzględniono łącznie 88 próbek od
pacjentów z rakiem nienaciekającym mięśniówki - NMIBC (pTa/pT1) i 12 próbek od
pacjentów z rakiem naciekającym mięśniówkę - MIBC (pT2). Wykresy PCA i OPLS-DA
wykazały niewielką ale statystycznie istotną separację między pTa/pT1 a pT2 BC.
Wyselekcjonowano 12 metabolitów istotnych w różnicowaniu między stopniami
zaawansowania raka pTa/pT1 i pT2: histydyna, alanina, tryptofan, glutamina, glicyna,
metylohistydyna, cholina, izomaślan, treonina, fenyloalanina, leucyna i
3-metylo-2-oksowalerianian. Wszystkie miały wyższe stężenia w surowicach pTa/pT1.
Dalsza analiza krzywej ROC pozwoliła na zawężenie listy do 9 metabolitów (histydyna,
alanina, tryptofan, glutamina, glicyna, metylohistydyna, cholina, izomaślan i treonina), które
wykazały największą zdolność dyskryminacyjną (AUC większe niż 0,75). Następnie
obliczono nowe AUC dla tego udoskonalonego modelu (który teraz uwzględniał tylko te 9
metabolitów) - wynosiło 0,844. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w profilu
metabolicznym pomiędzy surowicami pTa vs. pT1 vs. pT2.
Dalsza analiza obejmowała badanie z zastosowaniem ICP-OES 116 próbek surowicy - 65
surowic nowotworowych i 51 kontrolnych. Określono stężenie łącznie dla 12 pierwiastków.
Dane z analizy surowicy zostały podzielone losowo na dwa zestawy: treningowy (42
surowice kontrolne i 52 surowice nowotworowe) oraz walidacyjny (10 surowic kontrolnych i
13 surowic nowotworowych). Wykres PCA ujawnił tendencję do oddzielania obu grup w
zestawie treningowym. Z kolei analiza OPLS-DA pozwoliła na nieco lepsze zróżnicowanie
między pacjentami z rakiem a osobami kontrolnymi. Trzy pierwiastki - Cu, Fe, Li - wyróżniły
się w rozróżnianiu grup badawczych. Po przeprowadzeniu walidacji modelu, tylko Cu i Fe
zostały uznane za znaczące dyskryminatory obu grup. Wykres S analizy OPLS-DA dla
zestawu treningowego pokazał, że Fe był ujemnie skorelowany z rozdzielaniem grup
(P(corr)[1] <0,5), co wskazuje na znacznie wyższe stężenie tego pierwiastka w surowicy
pacjentów z BC w porównaniu z grupą kontrolną. Li natomiast wykazał dodatnią korelację z
rozdzielaniem grup (P(corr)[1] >0,5), co sugeruje wyższe stężenie tego pierwiastka w
próbkach surowicy osób kontrolnych. Analiza ROC wskazała Fe jako najbardziej znaczący
pierwiastek, z wartością AUC wynoszącą 0,850, czułością 0,8 i swoistością 0,8. Dla Li
wartość AUC wyniosła 0,710, czułość - 0,8, a swoistość - 0,6. Wydajność modelu ICP-OES
w rozróżnianiu próbek rakowych od kontrolnych oceniono na podstawie tych dwóch
wybranych pierwiastków (Fe i Li). Model wykazał wartość AUC wynoszącą 0,807, co
sugeruje dobrą moc dyskryminacyjną między grupą BC i NC.
Analizę surowicy z zastosowaniem LDI-MS przeprowadzono na 100 surowicach
nowotworowych i 100 surowicach kontrolnych. W tym celu zastosowano dwie metody
analityczne: PFL-2D GS LASiS AuNPs LDI-MS i PFL-2D GS LASiS 109AgNPs LDI-MS, co
pozwoliło na identyfikację odpowiednio 335 i 650 wartości m/z. Zebrane dane poddano
analizie statystycznej, dzieląc je na dwa podzbiory: treningowy, zawierający 160 próbek (80
od osób z rozpoznanym rakiem pęcherza moczowego (BC), 80 od osób zdrowych (NC)),
43
oraz walidacyjny składający się z 40 próbek (20 BC i 20 NC). Zastosowanie metod 2D-PCA i
OPLS-DA dla danych uzyskanych za pomocą analizy 109AgNPs LDI-MS pozwoliło na
wyraźne rozróżnienie między próbkami surowicy od osób z rozpoznanym rakiem pęcherza
moczowego i grupy kontrolnej w obu podzbiorach. Udało się zidentyfikować 216 wspólnych
cech m/z. Spośród nich 96 wartości m/z było obecnych w większej ilości w surowicy
pacjentów z BC, natomiast 119 cech prezentowało odwrotną tendencję. Co istotne,
połączenie wartości m/z okazało się lepszym dyskryminatorem pomiędzy grupami BC i NC
(AUC >0.99) niż niezależna ocena każdej cechy m/z (AUC >0,73). Następnie,
zidentyfikowane cechy widma masowego porównano z bazami danych metabolitów, co
umożliwiło domniemaną identyfikację 17 naturalnie występujących w organizmie człowieka
metabolitów. Podobne wyniki przyniosła analiza danych uzyskanych za pomocą techniki
PFL-2D GS LASiS AuNPs LDI-MS. W tym przypadku również zaobserwowano wyraźne
różnice między surowicą od osób z rozpoznanym rakiem pęcherza moczowego a surowicą
od osób zdrowych przy zastosowaniu analizy PCA i OPLS-DA. Analiza pozwoliła na
identyfikację 172 wspólnych cech. Spośród nich 44 wartości m/z były obecne w większej
ilości w surowicy od osób z rozpoznanym rakiem pęcherza moczowego, podczas gdy 128
cech prezentowało odwrotną tendencję. Tak jak w poprzednim przypadku, bardziej
efektywne okazało się wykorzystanie połączonej oceny cech widma masowego (AUC
>0.99), w porównaniu z wartościami AUC pojedynczych metabolitów. Kolejno
zidentyfikowane cechy widma masowego porównano z bazami danych metabolitów, co
umożliwiło identyfikację 8 metabolitów występujących w organizmie człowieka.
44
4.3 Analiza metabolomiczna moczu
Untargeted urinary metabolomics for bladder cancer biomarker screening with
ultrahigh-resolution mass spectrometry.Scientific Reports, 2023.
J. Nizioł, K. Ossoliński, A. Płaza-Altamer, A. Kołodziej, A. Ossolińska, T. Ossoliński, A.
Nieczaj, T. Ruman
Badanie miało na celu analizę metabolomiczną moczu na potrzby poszukiwania
potencjalnych biomarkerów raka pęcherza moczowego. Do analizy użyto spektrometrii mas
o ultra0wysokiej rozdzielczości (UHRMS) w połączeniu z ultra-wysokosprawną
chromatografią cieczową (UHPLC) na próbkach moczu pobranych od 100 chorych na raka
pęcherza moczowego (BC) oraz 100 osób z grupy kontrolnej (NC), uwzględniając stopień
zaawansowania klinicznego i stopień złośliwości histopatologicznej. Próbki moczu
podzielono na dwie części: zestaw treningowy zawierający 70% wszystkich próbek oraz
zestaw walidacyjny z pozostałymi 30%. Metaboliczne profilowanie moczu wykonano
oddzielnie dla obu zestawów. Zestaw treningowy posłużył do wykrycia biomarkerów
diagnostycznych w moczu, natomiast zestaw walidacyjny wykorzystano do niezależnego
potwierdzenia skuteczności wykrytych biomarkerów.
Analiza spektrometryczna wykazała łącznie 2969 wartości m/z (metabolitów) w
treningowym i walidacyjnym zbiorze danych. Analiza PCA wykazała dobrą separację między
pacjentami z rakiem a grupą kontrolną bazując na różnych profilach metabolitów.
Nadzorowana analiza wielowymiarowa z wykorzystaniem OPLS-DA dodatkowo podkreśliła
różnice metaboliczne między grupami BC i kontrolnymi. Kolejne testy permutacyjne
potwierdziły dokładność modelu OPLS-DA. Następnie przeprowadzono analizę ROC,
zarówno na zestawach treningowych, jak i walidacyjnych, aby ocenić zdolność
diagnostyczną modeli. Powierzchnia pod krzywą ROC (AUC) została wykorzystana do
analizy czułości i swoistości biomarkerów. Na podstawie wartości AUC >0,7 w połączeniu z
VIP >1 z modelu OPLS-DA i niezależnych testów t (wartość p i FDR <0,05), wybrano 464
zmienne w zbiorze treningowym i 548 zmiennych w zbiorze walidacyjnym, które uznano za
istotne.
Następnie wyselekcjonowano wspólny zestaw 51 wartości m/z, z czego 20 udało się
przyporządkować określonym związkom chemicznym. 5 z 51 wybranych metabolitów
wykazywało bardzo wysokie wartości AUC (>0,9), co wskazuje na doskonałą zdolność
dyskryminacyjną między próbkami moczu pochodzącego od pacjentów z nowotworem i
kontrolnych. Połączenie metabolitów z zestawu treningowego i walidacyjnego świetnie
różnicuje pomiędzy grupami BC vs. NC, z AUC > 0,979.
Dodatkowe analizy PCA i OPLS DA zostały wykonane na zbiorach danych treningowych (70
NC, 30 pacjentów z HG i 38 pacjentów z LG) oraz walidacyjnych (30 NC, 12 pacjentów z HG
i 17 pacjentów z LG). Miały na celu zweryfikowanie, czy badanie metabolomiczne próbek
moczu mogłoby służyć do rozróżniania stopni złośliwości histopatologicznej. Z analizy
wyłączono pacjentów z PLUMP z powodu ich niewielkiej liczebności. W ramach zestawów
treningowych i walidacyjnych, wykresy wyników PCA i OPLS-DA ujawniły wyraźną separację
45
pomiędzy grupami kontrolnymi a grupami nowotworowymi o różnym stopniu złośliwości
histopatologicznej (LG vs. NC i HG vs. NC). Kolejne testy permutacyjne potwierdziły
dokładność modelu OPLS-DA. Niemniej jednak na wykresie PCA nie zaobserwowano
znaczących różnic pomiędzy pacjentami z LG vs. HG. W modelu OPLS-DA
porównującym LG BC z NC, uznano 26 wykrytych związków chemicznych za znaczące (VIP
>1, wartość p <0,05) zarówno w zestawie treningowym, jak i walidacyjnym, zaś do analizy
porównującej HG BC z NC wyselekcjonowano 63 związki spełniające te kryteria. 2 z 26
metabolitów w modelu LG vs. NC i 13 z 63 w modelu HG vs. NC miały wartości AUC
powyżej 0,9.
Aby zidentyfikować różnice pomiędzy stopniami zaawansowania klinicznego raka pęcherza
moczowego, stworzono modele PCA i OPLS-DA. 68 próbek moczu od pacjentów z pTa BC
podzielono na grupy treningowe (70 NC, 47 pTa BC) i walidacyjne (30 NC, 21 pTa BC). 19
próbek moczu od pacjentów z pT1 BC również podzielono na grupy treningowe (70 NC, 15
pT1 BC) i walidacyjne (30 NC, 5 pT1 BC). W przypadku stadium pT2 BC ze względu na
małą liczbę próbek przeprowadzono analizę bez podziału grupy treningowe i walidacyjne (30
NC, 12 pT2 BC). Wykresy wyników PCA i OPLS-DA wykazały wyraźną separację między
NC a poszczególnymi stadiami BC (pTa vs. NC, pT1 vs. NC, i pT2 vs. NC). Testy permutacji
potwierdziły duże zróżnicowanie profili metabolitów między tymi grupami. Skuteczność
trzech modeli w różnicowaniu pomiędzy stopniami zaawansowania klinicznego pTa, pT1 i
pT2 oraz NC oceniono za pomocą analizy krzywej ROC. Opierając się na kryteriach odcięcia
(FC >2 lub <0,5, VIP >1; AUC >0.7, wartość p i FDR <0,05) wyselekcjonowano kolejno 19,
68 i 81 związków chemicznych, które najlepiej rozróżniały próbki moczu pomiędzy stadiami
pTa BC vs. NC, pT1 BC vs. NC i pT2 BC vs. NC. Porównanie trzech stopni
zaawansowania nowotworu pomiędzy sobą (pT1 vs. pTa vs. pT2) nie wykazało
istotnych różnic statystycznych.
Targeted and untargeted urinary metabolic profiling of bladder cancer. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2023
K. Ossoliński, T. Ruman, V. Copié, B.P. Tripet, A. Kołodziej, A. Płaza-Altamer, A.
Ossolińska, T. Ossoliński, A. Nieczaj, J. Nizioł
W niniejszej pracy zbadano profile metabolitów 200 próbek moczu uzyskanych od 100
pacjentek z rakiem pęcherza moczowego (BC) i 100 zdrowych osób (NC), z wykorzystaniem
celowanego i niecelowanego podejścia profilowania metabolomicznego. Zastosowane
techniki analityczne obejmowały wysokiej rozdzielczości 1H NMR oraz spektrometrię mas
opartą na nanocząstkach złota i srebra generowanych laserowo (PFL-2D GS LASiS AuNPs
LDI-MS oraz PFL-2D GS LASiS 109AgNPs LDI-MS). Do analizy statystycznej danych NMR
wykorzystano 99 próbek moczu. W przypadku jednej próbki nie można było uzyskać
odpowiednio wysokiej jakości widm NMR. Próbki moczu zostały podzielone na dwie grupy,
zestaw treningowy, obejmujący n = 70 próbek BC i NC oraz zestaw walidacyjny obejmujący
pozostałe n=30 BC i NC. Profilowanie metaboliczne surowicy przeprowadzono niezależnie
na obu zestawach danych. Zbiór treningowy został wykorzystany do identyfikacji markerów
diagnostycznych w moczu. Zbiór walidacyjny posłużył niezależnej walidacji skuteczności
diagnostycznej biomarkerów.
46
Analiza próbek moczu z zastosowaniem 1H NMR o wysokiej rozdzielczości pozwoliła na
zidentyfikowanie 39 metabolitów, które wykazywały znaczące różnice w stężeniach między
próbkami BC i NC. Zebrane dane NMR podzielono na podzbiory treningowe i walidacyjne w
celu skutecznej budowy i weryfikacji modelu. Analiza głównych składowych (PCA) obu
zestawów danych wykazała wyraźną separację między grupami BC i NC. Następnie
przeprowadzono analizę OPLS-DA na potrzeby zbadania zakresu różnic metabolicznych
między grupami BC i NC, w wyniku której uzyskano znaczącą separację grup w obu
zestawach danych. Analiza krzywej ROC wraz z określeniem VIP została przeprowadzona
na obu zestawach w celu oceny skuteczności diagnostycznej modeli OPLS-DA.
Wyselekcjonowano odpowiednio 15 i 16 metabolitów w zestawie treningowym i
walidacyjnym na podstawie połączonej analizy wyników VIP (> 1,), testów t (wartości p i
FDR <0,05) oraz analizy powierzchni pod krzywą ROC (AUC >0,7). 12 z nich powtarzało się
w obydwu zestawach. Ostatecznie 5 metabolitów zostało zidentyfikowanych jako istotne na
podstawie parametru FC >2 lub <0,5 (trygonelina, hipuran, mocznik, mannitol i
4-hydroksyfenylooctan). Potencjał diagnostyczny tych 5 metabolitów oceniono za pomocą
analiz krzywej ROC i modelowania random forest, które wykazały wysoki potencjał
dyskryminacji (AUC >0,828) między dwiema grupami w obydwu zestawach danych.
Najbardziej obiecujące wyniki zaobserwowano dla trygoneliny, mocznika, mannitolu i
4-hydroksyfenylooctanu, z których wszystkie osiągnęły wartości AUC większe niż 0,8.
Celem identyfikacji metabolitów rozróżniających pomiędzy stopniem złośliwości
histopatologicznej zastosowano analizę statystyczną, która obejmowała PCA, OPLS-DA i
jednokierunkowe analizy ANOVA zarówno na zestawach danych treningowych, jak i
walidacyjnych. Pula próbek składała się z 95 próbek moczu od pacjentów z rakiem o
wysokim stopniu złośliwości (HG) i niskim stopniu złośliwości (LG), z wyłączeniem próbek od
pacjentów z brodawkowatym nowotworem urotelialnym o niskim potencjale złośliwości
(PUNLMP). Zbiory danych treningowych i walidacyjnych zostały wykorzystane odpowiednio
do trenowania i walidacji modelu PCA. Zestaw treningowy składał się z 29 próbek HG, 36
LG i 69 NC, podczas gdy zestaw walidacyjny zawierał 11 próbek HG, 18 próbek LG i 30 NC.
Zarówno w zestawie treningowym, jak i walidacyjnym, wykresy wyników PCA i OPLS-DA
wykazały separację między grupami kontrolnymi i nowotworowymi (LG BC vs. NC i HG BC
vs. NC). Rozróżnienie pomiędzy LG vs HG na wykresie PCA było jedynie marginalne
(nieistotne statystycznie). Trzy metabolity, a mianowicie trygonelina, hipuran i mannitol,
okazały się statystycznie istotne (VIP > 1, wartość p, FDR 0,05, FC <0,5 lub >2, AUC >0,7)
w modelu OPLS-DA dla grup LG BC vs. NC oraz HG BC vs. NC, zarówno w zestawie
treningowym jak i walidacyjnym. Chociaż nienadzorowana analiza PCA nie zdołała rozróżnić
grup na podstawie różnych stopni złośliwości histopatologicznej (LG vs. BC), z
powodzeniem rozróżniała nowotworowe i kontrolne próbki moczu.
Następna analiza z zastosowaniem NMR posłużyła do próby identyfikacji metabolitów
rozróżniających pomiędzy stopniami zaawansowania klinicznego. W tym, celu zastosowano
analizę statystyczną, która obejmowała PCA, OPLS-DA i jednokierunkowe analizy ANOVA
zarówno na zestawach danych treningowych, jak i walidacyjnych.
47
Zbiór danych obejmował próbki moczu od 87 pacjentów z nieinwazyjnym rakiem pęcherza
moczowego - NMIBC (pTa i pT1) oraz 12 pacjentów z naciekającym mięśniówkę rakiem
pęcherza moczowego - MIBC (pT2). Zostały one podzielone na zestaw treningowy (n=48
pTa i n=69 NC) i zestaw walidacyjny (n=20 pTa i n=30 NC). Ze względu na ograniczoną
liczbę próbek w przypadku stadiów pT1 (n=34) i pT2 (n=12) analiza przeprowadzono jako
jeden zestaw, bez podziału na treningowy i walidacyjny. Wykresy wyników PCA i OPLS-DA
wykazały dobrą separację między próbkami kontrolnymi (NC) a różnymi stadiami BC (pTa
vs. NC, pT1 vs. NC i pT2 vs. NC). Analiza krzywej ROC dodatkowo potwierdziła
skuteczność modeli w rozróżnianiu stadiów pTa, pT1 i pT2 BC i NC. Bazując na ustalonych
kryteriach odcięcia (FC >2 lub <0,5, VIP >1; AUC 0,7, wartość p i FDR <0,05),
wyselekcjonowano metabolity mające największe znaczenie dla rozróżnienia między
grupami pTa BC vs. NC (6 metabolitów), pT1 BC vs. NC (10 metabolitów) oraz pT2 BC vs.
NC (7 metabolitów). W badaniu nie stwierdzono jednak statystycznie istotnych różnic
we wzorcach metabolitów, które mogłyby odróżnić między sobą trzy stopnie
zaawansowania klinicznego (pT1 vs. pTa vs. pT2).
Analiza metabolomiczna próbek moczu z zastosowaniem LDI-MS obejmowała metody
PFL-2D GS LASiS AuNPs i PFL-2D GS LASiS 109AgNPs LDI-MS. Do analizy wykorzystano
200 próbek moczu. Łącznie uzyskano 690 cech MS różnicujących grupy. Zbiór danych
został podzielony na zestaw treningowy (n=70 BC i n=70 NC) i zestaw walidacyjny (n=30 BC
i n=30 NC). Zarówno analizy PCA, jak i OPLS-DA doprowadziły do wyraźnej separacji
między grupą z rakiem pęcherza moczowego a grupą kontrolną na podstawie ich profili
metabolitów w moczu. Aby zidentyfikować najbardziej dyskryminujące cechy widma
masowego między grupami BC i NC, wybrano metabolity charakteryzujące się wartością VIP
>1 z modelu OPLS-DA.
● Analiza PFL-2D GS LASiS 109AgNPs LDI-MS
Zidentyfikowano 74 cechy widma masowego (m/z) wspólne dla zbiorów danych
treningowych i walidacyjnych, które spełniały określone kryteria (wartość VIP >1, wartość p
<0,05, FC <0,5 lub >1,8 oraz AUC >0,7). Dalszą analizę eksploracyjną ROC, opartą na
algorytmie random forest, przeprowadzono w celu zidentyfikowania najbardziej
dyskryminujących cech spektralnych m/z między grupami BC i kontrolnymi. 50-cechowy
panel w zestawie treningowym i 100-cechowy panel w zestawie walidacyjnym wykazały
doskonałą siłę dyskryminacji (AUC >0,97).
● Analiza PFL-2D GS LASiS PFL-2D GS LASiS AuNPs
W analizie obu podzbiorów (treningowyego i walidacyjnego) znaleziono 98 wspólnych cech z
wynikami VIP >1,, wartością p <0,05, FC <0,5 lub >1,8 i AUC >0,7. Spośród nich, 49 było
bardziej obfitych w próbkach moczu pacjentów z rakiem pęcherza moczowego, a 49 cech
wykazywało odwrotną tendencję. Identyfikację przypuszczalnych związków wybranych cech
widma masowego przeprowadzono poprzez porównanie obserwowanych cech widmowych
ze związkami obecnymi w bazach danych metabolitów. 25cech widma masowego
przypisano do metabolitów występujących u ludzi.
48
Podsumowanie i wnioski
Badanie pt. "Metabolomiczna analiza tkanki, surowicy i moczu w poszukiwaniu
potencjalnych biomarkerów raka pęcherza moczowego" miało na celu identyfikację
biomarkerów raka pęcherza moczowego poprzez przeprowadzenie kompleksowego
profilowania metabolomicznego próbek surowicy, moczu i tkanek. Według wiedzy autora jest
to jedyne badanie łączące analizę zarówno wszystkich dostępnych próbek biologicznych jak
i wszystkie dostępne metody analizy stosowanej w metabolomice. Obejmowało ono
zaawansowane techniki, takie jak spektrometra mas, NMR do analizy profilu
metabolomicznego raka pęcherza moczowego i rzadko stosowana metoda ICP-OES do
analizy profilu elementomicznego. Badanie wykazało odmienne profile metabolomiczne
pomiędzy pacjentami z rakiem pęcherza moczowego a grupą kontrolną. Zidentyfikowano
metabolity, które na podstawie analizy statystycznej wykazują potencjał jako możliwe
biomarkery diagnostyczne raka pęcherza moczowego.
Wyniki badania torują drogę do lepszego zrozumienia zmian metabolicznych związanych z
rakiem pęcherza moczowego. Zidentyfikowane metabolity stanowią obiecujący kierunek
rozwoju nieinwazyjnych narzędzi diagnostycznych i prognostycznych mogących poprawić
wczesne wykrywanie raka pęcherza moczowego i wyniki jego leczenia. Konieczne są jednak
dalsze badania walidacyjne w celu potwierdzenia tych ustaleń w większych i bardziej
zróżnicowanych kohortach pacjentów.
Mocne strony badania:
- Kompleksowe podejście. W badaniu zastosowano kompleksowe podejście
metabolomiczne i elementomiczne, badając próbki surowicy, moczu i tkanek,
zapewniając w ten sposób całościowy obraz zmian metabolicznych zachodzących w
raku pęcherza moczowego.
- Zaawansowane techniki. Zastosowanie zaawansowanych technik analitycznych (MS,
NMR i ICP-OES) ułatwiło wykrycie i identyfikację szerokiego zakresu metabolitów,
zwiększając szanse na znalezienie potencjalnych biomarkerów.
- Analiza ścieżek. Analiza zmienionych szlaków metabolicznych, a nie tylko
poszczególnych metabolitów, zapewnia głębsze zrozumienie mechanizmu choroby i
może pomóc w opracowaniu ukierunkowanych terapii.
- Potencjał dla testów nieinwazyjnych. Biorąc pod uwagę charakter zidentyfikowanych
biomarkerów, istnieje możliwość opracowania nieinwazyjnych testów do
diagnozowania i monitorowania raka pęcherza moczowego, co może poprawić
dokładność diagnostyczną, obniżyć koszty diagnostyki i monitorowania pacjentów z
rakiem pęcherza moczowego, jednocześnie zwiększając komfort i przestrzeganie
zaleceń przez pacjentów.
49
W publikacji pt. “Monoisotopic silver nanoparticles-based mass spectrometry imaging
of human bladder cancer tissue: Biomarker discovery” przeanalizowano fragmenty
tkanek pochodzące od pacjentów z rakiem pęcherza moczowego. Poza zidentyfikowaniem
poszczególnych metabolitów rozróżniających tkankę nowotworową i kontrolną
przeanalizowano dodatkowo szlaki metaboliczne, w których występują, oraz określono ich
związek z nowotworzeniem. Analiza ujawniła wyraźne różnice między nowotworową a
prawidłową tkanką pęcherza moczowego, wskazując na potencjał tych metabolitów jako
markerów diagnostycznych raka pęcherza moczowego. Lipidy odegrały znaczącą rolę wśród
zidentyfikowanych biomarkerów, odzwierciedlając ich zaangażowanie w różne procesy
komórkowe oraz podkreślając znaczenie w metabolizmie nowotworów i szlakach
sygnałowych. Aminokwasy, takie jak glicyna i glutamina, wykazywały obniżone poziomy w
tkance nowotworowej, co sugeruje ich potencjał jako wskaźników metabolizmu guza
poprzez zwiększone zapotrzebowanie w procesie proliferacji komórek nowotworowych. Inne
metabolity z różnych klas chemicznych, w tym aldehydy, osmoprotektanty i związki
organiczne, zostały również zidentyfikowane jako potencjalne biomarkery. Integracja
wielowymiarowej analizy statystycznej pozwoliła na kompleksową ocenę potencjału
diagnostycznego zidentyfikowanych metabolitów. Wykazano również, że wartość AUC dla
grupy metabolitów jest wyższa niż każdego z nich oddzielnie, wskazując na znaczenie
uwzględnienia grupy metabolitów celem poprawy ich dokładności diagnostycznej. Wysokie
wartości AUC uzyskane z analizy ROC sygnalizują na potencjalną użyteczność kliniczną
tych metabolitów jako narzędzi diagnostycznych w przypadku raka pęcherza moczowego,
mających potencjał choćby do wspomagania analizy histopatologicznej - zastosowanie
metody obrazowania LDI-MSI pozwoliło na graficzne zobrazowanie w przestrzeni
dwuwymiarowej rozkładu poszczególnych metabolitów.
W publikacjach pt. “Untargeted ultra-high-resolution mass spectrometry metabolomic
profiling of blood serum in bladder cancer.” oraz “Metabolomic and elemental
profiling of blood serum in bladder cancer.” przeanalizowano surowice pochodzące od
pacjentów z rakiem pęcherza moczowego oraz surowice kontrolne. W pierwszej publikacji
zastosowano ultra-wysokowydajną chromatografię cieczową (UHPLC) połączoną z
ultra-wysokorozdzielczą spektrometrią mas (UHRMS) do niecelowanego profilowania
metabolomicznego 200 próbek ludzkiej surowicy, aby zidentyfikować sygnatury
biochemiczne różnicujące raka pęcherza moczowego od surowic kontrolnych. Jedno- i
wielozmiennowe analizy statystyczne z zewnętrzną walidacją wykazały 27 metabolitów
różnicujących surowice pochodzące od pacjentów z rakiem pęcherza i kontrolne. Obfitość
tych metabolitów wykazywała istotne różnice statystyczne w dwóch niezależnych zestawach
szkoleniowych i walidacyjnych. Zidentyfikowano również 23 metabolity różnicujące surowice
pochodzące od pacjentów z rakiem o niskim i wysokim stopniu złośliwości histopatologicznej
w porównaniu z surowicami kontrolnymi. 37 metabolitów w surowicy różnicowało odmienne
stadia zaawansowania klinicznego BC w porównaniu z surowicami kontrolnymi. Nie
stwierdzono jednak statystycznie istotnych różnic w profilach metabolicznych w analizie
porównawczej pomiędzy poszczególnymi stopniami złośliwości histopatologicznej i
zaawansowania klinicznego. Poza zidentyfikowaniem poszczególnych metabolitów
przeanalizowano również szlaki metaboliczne, w których dane związki występują, oraz
określono ich korelację z nowotworzeniem. Wyniki sugerują, że pomiar metabolitów w
surowicy z zastosowaniem spektrometrii może zapewnić dokładną i mało inwazyjną metodę
diagnostyczną do wykrywania raka pęcherza moczowego.
50
W publikacji pt. “Metabolomic and elemental profiling of blood serum in bladder
cancer” wykazano, że kompleksowy zestaw narzędzi obejmujący NMR o wysokiej
rozdzielczości, ICP-OES i LDI-MS w połączeniu z wielowymiarową analizą statystyczną jest
potężnym narzędziem do analizy zmian metabolomicznych i elementomicznych
zachodzących w raku pęcherza moczowego. W kontekście identyfikacji biomarkerów za
pomocą spektroskopii 1H NMR, zidentyfikowano 4 potencjalne biomarkery metaboliczne,
które wykazały potencjał predykcyjny z AUC >0,999 do rozróżniania surowicy nowotworowej
z kontrolną. Zaobserwowano również, że stężenia żelaza i litu różniły się znacząco w
surowicy zdrowych osób w porównaniu z pacjentami z rakiem pęcherza moczowego. Co
więcej, wyniki LDI-MS ujawniły 22 związki, głównie (glikosfingo)lipidy, które mogą
różnicować próbki nowotworowe i kontrolne. Wyselekcjonowano 5 metabolitów, które mogą
potencjalnie służyć jako biomarkery do rozróżniania raka pęcherza moczowego o niskim
stopniu złośliwości (LG) i raka pęcherza moczowego o wysokim stopniu złośliwości (HG), a
także 9 metabolitów, które mogą pomóc w rozróżnieniu stadiów zaawansowania choroby
pTa/pT1 (NMIBC) i pT2 (MIBC). Nie stwierdzono jednak istotnych statystycznie różnic w
profilu metabolicznym pomiędzy surowicami pTa vs. pT1 vs. pT2. Wyniki te podkreślają
znaczenie zróżnicowanych profili metabolitów w surowicy nie tylko w procesie rozróżniania
surowicy od pacjentów z rakiem pęcherza moczowego (BC) od surowicy zdrowych osób
(NC), ale także w kontekście zdolności do rozróżniania pomiędzy rakiem NMIBC i MIBC
oraz rozróżnieniem pomiędzy stopniami złośliwości histopatologicznej. Poza
zidentyfikowaniem poszczególnych metabolitów, przeanalizowano szlaki metaboliczne w
których występują oraz określono ich związek z nowotworzeniem. Badanie wykazało też, że
wartość predykcyjna dla połączonych profili metabolitów jest wyższa w porównaniu z
pojedynczymi związkami.
W publikacjach pt. “Untargeted urinary metabolomics for bladder cancer biomarker
screening with ultrahigh-resolution mass spectrometry” oraz “Targeted and untargeted
urinary metabolic profiling of bladder cancer” przeanalizowano próbki moczu
pochodzące od pacjentów z rakiem pęcherza moczowego oraz próbki moczu kontrolne. W
pierwszej publikacji zastosowano spektrometrię mas o ultra-wysokiej rozdzielczości w
dokładnej identyfikacji różnic w metabolomie moczu pacjentów z rakiem pęcherza
moczowego (BC). Zidentyfikowano liczne metabolity, które mogą potencjalnie w sposób
bezinwazyjny różnicować próbki moczu pacjentów z rakiem pęcherza moczowego od próbek
moczu osób zdrowych. Poza wskazaniem poszczególnych metabolitów, przeanalizowano
szlaki metaboliczne w których występują. Nie udało się jednak zidentyfikować metabolitów,
różnicujących próbki moczu pomiędzy odmiennymi stopniami zaawansowania klinicznego i
stopniami złośliwości histopatologicznej. Odkrycia te mogą odegrać znaczącą rolę w
opracowaniu prostych, nieinwazyjnych i wysoce czułych testów diagnostycznych zdolnych
do wykrywania raka pęcherza moczowego.
W publikacji pt. “Targeted and untargeted urinary metabolic profiling of bladder cancer”
zastosowano zaawansowane techniki analityczne, takie jak NMR o wysokiej rozdzielczości i
LDI-MS do analizy profilu metabolomicznego moczu u pacjentów z rakiem pęcherza
moczowego. Podejście to doprowadziło do wykrycia 5 potencjalnych biomarkerów raka
pęcherza moczowego - 4-hydroksyfenylooctan, hipuran, mannitol, trygonelina i mocznik.
Metabolity te łącznie wykazywały doskonałą zdolność predykcyjną do rozróżniania między
moczem pochodzącym od pacjentów z rakiem pęcherza moczowego i kontrolnych, z
wartościami AUC przekraczającymi 0,82. Dzięki zastosowaniu technik LDI-MS
51
zidentyfikowano szereg dodatkowych związków tj. związki aromatyczne, aminokwasy oraz
kwasy karboksylowe i ich pochodne. Poza ujawnieniem poszczególnych metabolitów,
przeanalizowano szlaki metaboliczne w których występują. Nie zidentyfikowano metabolitów
różnicujących moczy pochodzących od pacjentów z różnymi stopniami zaawansowania
klinicznego i stopniami złośliwości histopatologicznej. Zbierając powyższe w badaniu
wykazano, że identyfikacja zmian metabolicznych w moczu może utorować drogę do
opracowania nieinwazyjnej metody diagnostycznej do diagnozowania oraz monitorowania
leczenia pacjentów z rakiem pęcherza moczowego.
Podsumowując, wszystkie główne i poboczne cele badawcze zostały zrealizowane. Jednym
z ograniczeń badania jest stosunkowo mała grupa badawcza (12 pacjentów) z rakiem
pęcherza moczowego naciekającego mięśniówkę (MIBC), co może się przekładać na niską
istotność statystyczną wyników porównujących grupy pTa/pT1 (NMIBC) vs. MIBC (pT2). W
planowaniu kolejnych badań ten element musi być uwzględniony. Dodatkowo zdefiniowano
inne ograniczenia badania, które również należy uwzględnić w dalszych badaniach:
- Walidacja wyników. Biomarkery zidentyfikowane w tym badaniu wymagają walidacji
w większych, niezależnych kohortach, a ich użyteczność kliniczna musi zostać
oceniona w prospektywnych badaniach klinicznych, zanim zostaną one przyjęte do
praktyki klinicznej.
- Potrzeba badań prospektywnych. Chociaż niniejsze badanie dostarcza istotnych
informacji na temat potencjalnych biomarkerów raka pęcherza moczowego, wyniki te
są zasadniczo wstępne. Zidentyfikowane potencjalne biomarkery wymagają dalszej
walidacji w większych i bardziej zróżnicowanych populacjach pacjentów. Co więcej,
skuteczność kliniczna tych biomarkerów musi zostać oceniona w badaniach
prospektywnych, zanim zostaną one włączone do praktyki klinicznej. Konieczne jest
wykazanie ich wartości w stosunku do istniejących metod diagnostycznych i
prognostycznych poprzez badania porównujące różne metody.
- Potrzeba specjalistycznego sprzętu. Podczas gdy spektrometry mas stosowane są
przez liczne laboratoria w Polsce i na świecie do mikrobiologii i toksykologii
wdrożenie możliwości identyfikacji poszczególnych biomarkerów wymagałoby
opracowania ustandaryzowanych wzorców do ich identyfikacji i kwantyfikacji.
Spektroskopy jądrowego rezonansu magnetycznego to narzędzia bardzo drogie
służącae jak na razie tylko do celów badawczych i naukowych.
- Określenie dokładnych stężeń odkrytych biomarkerów. Podczas gdy MS jest bardziej
czuła i może wykryć szerszy zakres metabolitów, często ma trudności z
zapewnieniem bezwzględnej kwantyfikacji. Z drugiej strony, NMR, choć mniej czuły,
zapewnia bardziej wiarygodne dane ilościowe. Dlatego też określenie konkretnych
stężeń wykrytych biomarkerów może stanowić wyzwanie w zależności od
zastosowanej metody analitycznej.
- Ograniczona przydatność kliniczna biomarkerów tkankowych. Mimo, że analiza
metabolomiczna tkanek zapewnia cenny wgląd w biologię raka pęcherza
moczowego, jej przełożenie na zastosowanie kliniczne stanowi wyzwanie. Inwazyjny
charakter pobierania próbek tkanek, ich koszt i wymóg specjalistycznej infrastruktury
do przechowywania i przetwarzania sprawiają, że biomarkery moczu i surowicy są
bardziej pożądane do rutynowego stosowania klinicznego.
52
Streszczenie
Praca doktorska pt. “Metabolomiczna analiza tkanki, surowicy i moczu w poszukiwaniu
biomarkerów raka pęcherza moczowego” stanowi cykl 5 artykułów opublikowanych w
czasopismach posiadających wskaźnik impact factor. Jestem pierwszym autorem trzech
publikacji oraz współautorem pozostałych dwóch. Temat pracy doktorskiej porusza
zagadnienie metabolicznych biomarkerów nowotworowych raka pęcherza moczowego które
mogłyby być potencjalnie wykorzystywane w praktyce klinicznej.
Artykuły przedstawiają metabolomiczną analizę tkanki nowotworowej, surowicy i moczu
pochodzącej od 100 pacjentów z rakiem pęcherza moczowego w porównaniu z tkanką,
surowicą i moczem kontrolnym pochodzących od 100 pacjentów z innymi, łagodnymi,
schorzeniami w obrębie dróg moczowych. Zastosowane techniki analityczne obejmują
wysokiej rozdzielczości 1H NMR, ICP-OES i wysokiej rozdzielczości laserową
desorpcję/jonizację MS (LDI-MS) opartą na nanocząstkach złota i srebra oraz spektrometrię
mas o ultra-wysokiej rozdzielczości (UHRMS) w połączeniu z ultra-wysokosprawną
chromatografią cieczową (UHPLC). Wielowymiarowa analiza statystyczna i analiza krzywej
ROC pozwoliły na kompleksową ocenę potencjału diagnostycznego zidentyfikowanych
metabolitów. Połączenie poziomów tych metabolitów poprawiło rozróżnienie między
materiałem biologicznym pochodzącym od pacjentów z rakiem pęcherza moczowego w
porównaniu z kontrolą, sugerując, że uwzględnienie wielu biomarkerów może być kluczowe
dla precyzyjnej diagnozy. Dodatkowo analiza NMR próbek surowicy pozwoliła na
wyselekcjonowanie metabolitów, które odróżniają raka NMIBC i MIBC oraz metabolitów
różnicujących stopień złośliwości histopatologicznej (LG vs. HG). Wysokie wartości
obszarów pod krzywymi ROC wskazują na potencjalne zastosowanie kliniczne tych
metabolitów jako narzędzi diagnostycznych w przypadku raka pęcherza moczowego
Analizując dane z obrazowania MS, wyselekcjonowano 10 metabolitów różnicujących próbki
tkanki nowotworowej od zdrowej, które wykazały wysoką dokładność diagnostyczną w
analizie krzywej ROC, każdy z polem pod krzywą AUC >0.99. Analiza szlaków pozwoliła na
umiejscowienie tych metabolitów w 17 różnych szlakach metabolicznych.
Analiza surowicy z zastosowaniem metody 1H NMR pozwoliła na identyfikację 4 metabolitów
różnicujące surowice nowotworowe i kontrolne z doskonałą zdolnością predykcyjną
określoną na podstawie pola pod krzywą AUC wynoszącą 0.999. Analiza z zastosowaniem
ICP-OES zidentyfikowała dwa pierwiastki (Fe i Li) z polem pod krzywą AUC wynoszącą
0,807. Analiza z zastosowaniem spektrometrii mas LDI-MS oraz wysokorozdzielcza
spektrometria mas UHRMS umożliwiła dodatkową identyfikację odpowiednio 25 i 27
metabolitów różnicujących obydwie grupy. Ponadto w analizie LDI-MS i UHRMS
odpowiednio 5 i 23 metabolity wykazywały zdolność do rozróżnienia pomiędzy
poszczególnymi stopniami złośliwości histopatologicznej (grade) a surowicą kontrolną oraz 9
i 37 metabolity, które rozróżniały pomiędzy poszczególnymi stopniami zaawansowania
klinicznego (stage) a surowicą kontrolną. Wyselekcjonowano 5 metabolitów, które mogą
potencjalnie służyć jako biomarkery do rozróżniania raka pęcherza moczowego o niskim
stopniu złośliwości (LG) i raka pęcherza moczowego o wysokim stopniu złośliwości (HG), a
także 9 metabolitów, które mogą pomóc w rozróżnieniu stadiów zaawansowania choroby
53
pTa/pT1 (NMIBC) i pT2 (MIBC). Analiza szlaków i wzbogacona analiza szlaków pozwoliły na
umiejscowienie metabolitów w łącznie 24 różnych szlakach metabolicznych (17+7).
Próbki moczu poddano analizie 1H NMR, LDI-MS oraz UHRMS. Zidentyfikowano
odpowiednio 5, 25 i 51 metabolitów różnicujących mocz pochodzący od pacjentów z rakiem
pęcherza moczowego w porównaniu z kontrolnymi próbkami moczu. Wszystkie metabolity z
analizy 1H NMR, LDI-MS charakteryzowały się wysoką wartością predykcyjną określoną na
podstawie pola pod krzywą AUC > 0,87, zaś 5 z 51 metabolitów z analizy UHRMS
charakteryzowało się bardzo wysokim wskaźnikiem AUC > 0,9. Udało się również
zidentyfikować metabolity które rozróżniają pomiędzy poszczególnymi stopniami
zaawansowania klinicznego i stopniami złośliwości histopatologicznej w porównaniu z
kontrolnymi próbkami moczu. Nie zidentyfikowano jednak statystycznie istotnych różnic we
wzorcach metabolitów, które rozróżniałyby między sobą poszczególne stopnie
zaawansowania klinicznego (pTa vs. pT vs. pT2) lub stopnie złośliwości histopatologicznej
(LG vs HG). Analiza szlaków i wzbogacona analiza szlaków obydwu publikacji dotyczących
analizy metabolomicznej moczu pozwoliły na umiejscowienie metabolitów w łącznie 7
różnych szlakach metabolicznych (3+4).
Podsumowując wyniki tego badania dostarczają informacji na temat potencjalnych
biomarkerów metabolicznych raka pęcherza moczowego oraz powiązanych z nim zmian
metabolicznych zachodzących w raku pęcherza moczowego. Zidentyfikowane metabolity, na
podstawie wyników analizy statystycznej, wykazują potencjał jako biomarkery diagnostyczne
dla tego nowotworu. Analiza szlaków metabolicznych, w których występują te metabolity,
oraz ich związek z procesami nowotworowymi dodatkowo umożliwiają lepsze zrozumienie
patogenezy i biologii raka pęcherza moczowego. Dalsze badania i weryfikacja tych wyników
może przyczynić się do rozwoju nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych z
zakresu omawianej choroby.
54
Streszczenie po angielsku
The dissertation entitled: "Metabolomic analysis of tissue, serum and urine in the search for
biomarkers of bladder cancer" is a series of 5 articles published in impact factor journals. I
am the first author of three publications and co-author of the other two. The dissertation topic
addresses the issue of metabolic tumor biomarkers for bladder cancer that could potentially
be used in clinical practice.
The articles presents a metabolomic analysis of tumor tissue, serum and urine from 100
patients with bladder cancer compared to tissue, serum and control urine from 100 patients
with other, benign, urinary tract conditions. Analytical techniques used include
high-resolution 1H NMR, ICP-OES and high-resolution laser desorption/ionization MS
(LDI-MS) based on gold and silver nanoparticles, and ultra-high-resolution mass
spectrometry (UHRMS) combined with ultra-high performance liquid chromatography
(UHPLC). Multivariate statistical analysis and ROC curve analysis allowed a comprehensive
evaluation of the diagnostic potential of the identified metabolites. Combining the levels of
these metabolites improved the distinction between biological material from bladder cancer
patients compared to controls, suggesting that consideration of multiple biomarkers may be
crucial for accurate diagnosis. In addition, NMR analysis of serum samples allowed the
selection of metabolites that distinguish between NMIBC and MIBC cancers, as well as
metabolites that differentiate cancer grades (LG vs. HG). The high values of the areas under
the ROC curves indicate the potential clinical use of these metabolites as diagnostic tools for
bladder cancer
Analyzing MS imaging data, 10 metabolites were found to differentiate samples of cancerous
tissue from healthy tissue that showed high diagnostic accuracy in ROC curve analysis,
each with an area under the curve AUC > 0,99. Pathway analysis placed these metabolites
in 17 different metabolic pathways.
Serum analysis using 1H NMR identified 4 metabolites differentiating tumor and control sera
with excellent predictive ability as determined by the area under the AUC curve of 0.999.
Analysis using ICP-OES identified 2 elements: Fe and Li with an area under the AUC curve
of 0.807. Analysis using LDI-MS mass spectrometry and high-resolution UHRMS mass
spectrometry allowed the additional identification of 25 and 27 metabolites, respectively,
differentiating the two groups. In addition, in LDI-MS and UHRMS analysis, 5 and 23
metabolites, respectively, showed the ability to discriminate between different cancer grades
and control serum, and 9 and 37 metabolites that discriminated between different cancer
stage and control serum. 5 metabolites were selected that could potentially serve as
biomarkers to distinguish between low-grade bladder cancer (LG) and high-grade bladder
cancer (HG), as well as nine metabolites that could help distinguish between NMIBC
(pTa/pT1) and MIBC (pT2) . Pathway analysis and enriched pathway analysis located
metabolites in a total of 24 different metabolic pathways (17+7).
Urine samples were subjected to 1H NMR, LDI-MS and UHPLC-UHRMS analysis. A 5, 25
and 51 metabolites were identified, respectively, differentiating urine from bladder cancer
patients compared to controls. All metabolites from the 1H NMR, LDI-MS analysis had a high
predictive value as determined by area under the curve AUC > 0,87, while 5 of the 51
55
metabolites from the UHPLC-UHRMS analysis had a very high AUC of more than 0,9.
Moreover metabolites that discriminate between different clinical stages and grades in
comparison to control urine samples were identified. However, no statistically significant
differences in metabolite patterns were identified that distinguished between stages (pTa vs.
pT1 vs. pT2) or grades (LG vs. HG). Pathway analysis and enriched pathway analysis of
both publications on urine metabolomic analysis allowed us to locate metabolites in a total of
7 different metabolic pathways (3+4).
In summary, the results of this study provide information on potential metabolic biomarkers
for bladder cancer and related metabolic changes occurring in bladder cancer. The identified
metabolites, based on the results of statistical analysis, show potential as diagnostic
biomarkers for this cancer. Analysis of the metabolic pathways involved in these metabolites
and their association with tumorigenic processes further provides a better understanding of
the pathogenesis and biology of bladder cancer. Further research and verification of these
findings may contribute to the development of new diagnostic and therapeutic strategies for
this disease.
56
Piśmiennictwo
1. Cancer today. (n.d.). Cancer Today. http://gco.iarc.fr/today/home
2. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008 - PubMed.
(2010, December 15). PubMed. https://doi.org/10.1002/ijc.25516
3. American Cancer Society | Cancer Facts & Statistics. (n.d.). American Cancer
Society | Cancer Facts & Statistics. http://cancerstatisticscenter.cancer.org/
4. Siegel, R. L., Miller, K. D., & Jemal, A. (2018, January). Cancer statistics, 2018. CA:
A Cancer Journal for Clinicians,68(1), 7–30. https://doi.org/10.3322/caac.21442
5. Kiemeney, L. A. L. M. (2008, January 1). Hereditary bladder cancer. Scandinavian
Journal of Urology and Nephrology,42(sup218), 110–115.
https://doi.org/10.1080/03008880802283755
6. Burger, M., Catto, J. W., Dalbagni, G., Grossman, H. B., Herr, H., Karakiewicz, P.,
Kassouf, W., Kiemeney, L. A., La Vecchia, C., Shariat, S., & Lotan, Y. (2013,
February). Epidemiology and Risk Factors of Urothelial Bladder Cancer. European
Urology,63(2), 234–241. https://doi.org/10.1016/j.eururo.2012.07.033
7. Rink, M., Crivelli, J. J., Shariat, S. F., Chun, F. K., Messing, E. M., & Soloway, M. S.
(2015, August). Smoking and Bladder Cancer: A Systematic Review of Risk and
Outcomes. European Urology Focus,1(1), 17–27.
https://doi.org/10.1016/j.euf.2014.11.001
8. Dryson, E., ’t Mannetje, A., Walls, C., McLean, D., McKenzie, F., Maule, M., Cheng,
S., Cunningham, C., Kromhout, H., Boffetta, P., Blair, A., & Pearce, N. (2007,
November 20). Case-control study of high risk occupations for bladder cancer in New
Zealand. International Journal of Cancer,122(6), 1340–1346.
https://doi.org/10.1002/ijc.23194
9. Rollinson, D., Knopp, S., Levitz, S., Stothard, J. R., Tchuem Tchuenté, L. A., Garba,
A., Mohammed, K. A., Schur, N., Person, B., Colley, D. G., & Utzinger, J. (2013,
November). Time to set the agenda for schistosomiasis elimination. Acta Tropica,
128(2), 423–440. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2012.04.013
10. MacLennan, G. T., & Bostwick, D. G. (2019, April 15). Urologic Surgical Pathology (L.
Cheng, Ed.). Saunders.
11. Humphrey, P. A., Moch, H., Cubilla, A. L., Ulbright, T. M., & Reuter, V. E. (2016, July).
The 2016 WHO Classification of Tumours of the Urinary System and Male Genital
Organs—Part B: Prostate and Bladder Tumours. European Urology,70(1), 106–119.
https://doi.org/10.1016/j.eururo.2016.02.028
12. Lopez-Beltran, A. (2008, January 1). Bladder cancer: Clinical and pathological profile.
Scandinavian Journal of Urology and Nephrology,42(sup218), 95–109.
https://doi.org/10.1080/03008880802325226
13. Wein, A. J., Kavoussi, L. R., Partin, A. W., & Peters, C. A. (2015, November 5).
Campbell-Walsh Urology: 4-Volume Set. Elsevier.
14. Shokeir, A. (2004, January). Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology,
diagnosis and treatment. BJU International,93(2), 216–220.
https://doi.org/10.1111/j.1464-410x.2004.04588.x
15. EL-Mekresh, EL-Baz, Abol-Enein, & Ghoneim. (1998, August). Primary
adenocarcinoma of the urinary bladder: BJU International,82(2), 206–212.
https://doi.org/10.1046/j.1464-410x.1998.00718.x
57
16. Abol-Enein, H., Kava, B. R., & Carmack, A. J. (2007, January). Nonurothelial Cancer
of the Bladder. Urology,69(1), 93–104. https://doi.org/10.1016/j.urology.2006.08.1107
17. Wright, J. L., Porter, M. P., Li, C. I., Lange, P. H., & Lin, D. W. (2006). Differences in
survival among patients with urachal and nonurachal adenocarcinomas of the
bladder. Cancer,107(4), 721–728. https://doi.org/10.1002/cncr.22059
18. Humphrey, P. A., Moch, H., Cubilla, A. L., Ulbright, T. M., & Reuter, V. E. (2016, July).
The 2016 WHO Classification of Tumours of the Urinary System and Male Genital
Organs—Part B: Prostate and Bladder Tumours. European Urology,70(1), 106–119.
https://doi.org/10.1016/j.eururo.2016.02.028
19. Mishriki, S. F., Nabi, G., & Cohen, N. P. (2008, January). Diagnosis of Urologic
Malignancies in Patients with Asymptomatic Dipstick Hematuria: Prospective Study
with 13 Years’ Follow-up. Urology,71(1), 13–16.
https://doi.org/10.1016/j.urology.2007.08.031
20. Grossfeld, G. D., Litwin, M. S., Wolf, J., Hricak, H., Shuler, C. L., Agerter, D. C., &
Carroll, P. R. (2001, April). Evaluation of asymptomatic microscopic hematuria in
adults: the American Urological Association best practice policy—part I: definition,
detection, prevalence, and etiology. Urology,57(4), 599–603.
https://doi.org/10.1016/s0090-4295(01)00919-0
21. Kamat, A. M., Hegarty, P. K., Gee, J. R., Clark, P. E., Svatek, R. S., Hegarty, N.,
Shariat, S. F., Xylinas, E., Schmitz-Dräger, B. J., Lotan, Y., Jenkins, L. C., Droller, M.,
van Rhijn, B. W., & Karakiewicz, P. I. (2013, January). ICUD-EAU International
Consultation on Bladder Cancer 2012: Screening, Diagnosis, and Molecular Markers.
European Urology,63(1), 4–15. https://doi.org/10.1016/j.eururo.2012.09.057
22. Jocham, D., Stepp, H., & Waidelich, R. (2008, June). Photodynamic Diagnosis in
Urology: State-of-the-Art. European Urology,53(6), 1138–1150.
https://doi.org/10.1016/j.eururo.2007.11.048
23. Kamat, A. M., Hegarty, P. K., Gee, J. R., Clark, P. E., Svatek, R. S., Hegarty, N.,
Shariat, S. F., Xylinas, E., Schmitz-Dräger, B. J., Lotan, Y., Jenkins, L. C., Droller, M.,
van Rhijn, B. W., & Karakiewicz, P. I. (2013, January). ICUD-EAU International
Consultation on Bladder Cancer 2012: Screening, Diagnosis, and Molecular Markers.
European Urology,63(1), 4–15. https://doi.org/10.1016/j.eururo.2012.09.057
24. Svatek, R. S., Sagalowsky, A. I., & Lotan, Y. (2006, July). Economic impact of
screening for bladder cancer using bladder tumor markers: A decision analysis.
Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations,24(4), 338–343.
https://doi.org/10.1016/j.urolonc.2005.11.025
25. Lokeshwar, V. B., Habuchi, T., Grossman, H. B., Murphy, W. M., Hautmann, S. H.,
Hemstreet, G. P., Bono, A. V., Getzenberg, R. H., Goebell, P., Schmitz-Dräger, B. J.,
Schalken, J. A., Fradet, Y., Marberger, M., Messing, E., & Droller, M. J. (2005,
December). Bladder tumor markers beyond cytology: International Consensus Panel
on bladder tumor markers. Urology,66(6), 35–63.
https://doi.org/10.1016/j.urology.2005.08.064
26. Sievert, K. D., Amend, B., Nagele, U., Schilling, D., Bedke, J., Horstmann, M.,
Hennenlotter, J., Kruck, S., & Stenzl, A. (2009, March 7). Economic aspects of
bladder cancer: what are the benefits and costs? World Journal of Urology,27(3),
295–300. https://doi.org/10.1007/s00345-009-0395-z
27. Lokeshwar, V. B., Habuchi, T., Grossman, H. B., Murphy, W. M., Hautmann, S. H.,
Hemstreet, G. P., Bono, A. V., Getzenberg, R. H., Goebell, P., Schmitz-Dräger, B. J.,
Schalken, J. A., Fradet, Y., Marberger, M., Messing, E., & Droller, M. J. (2005,
58
December). Bladder tumor markers beyond cytology: International Consensus Panel
on bladder tumor markers. Urology,66(6), 35–63.
https://doi.org/10.1016/j.urology.2005.08.064
28. Kotarba. (n.d.). Spektrometria mas w badaniu materiałów - wykład.
29. Veenstra, T. D. (2012). Metabolomics: the final frontier? Genome Medicine,4(4), 40.
https://doi.org/10.1186/gm339
30. Griffin, J. L., & Shockcor, J. P. (2004, July 1). Metabolic profiles of cancer cells.
Nature Reviews Cancer,4(7), 551–561. https://doi.org/10.1038/nrc1390
31. Meding, S., Nitsche, U., Balluff, B., Elsner, M., Rauser, S., Schöne, C., Nipp, M.,
Maak, M., Feith, M., Ebert, M. P., Friess, H., Langer, R., Höfler, H., Zitzelsberger, H.,
Rosenberg, R., & Walch, A. (2012, February 3). Tumor Classification of Six Common
Cancer Types Based on Proteomic Profiling by MALDI Imaging. Journal of Proteome
Research,11(3), 1996–2003. https://doi.org/10.1021/pr200784p
32. Beginner’s Guide to Mass Spectrometry | Waters. (n.d.). Beginner’s Guide to Mass
Spectrometry | Waters.
https://www.waters.com/nextgen/en/education/primers/the-mass-spectrometry-primer
.html
33. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., & Li, L. (2017, December 13). Mass
Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.
Analytical Chemistry,90(1), 240–265. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b04733
34. Müller, W. H., Verdin, A., De Pauw, E., Malherbe, C., & Eppe, G. (2020, November
10). Surface‐assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging: A
review. Mass Spectrometry Reviews,41(3), 373–420.
https://doi.org/10.1002/mas.21670
35. NMR Spectroscopy Principles, Interpreting an NMR Spectrum and Common
Problems. (n.d.). Analysis & Separations From Technology Networks.
http://www.technologynetworks.com/analysis/articles/nmr-spectroscopy-principles-int
erpreting-an-nmr-spectrum-and-common-problems-355891
36. Emwas, A. H. M. (2015). The Strengths and Weaknesses of NMR Spectroscopy and
Mass Spectrometry with Particular Focus on Metabolomics Research. Methods in
Molecular Biology, 161–193. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2377-9_13
37. Amberg, A., Riefke, B., Schlotterbeck, G., Ross, A., Senn, H., Dieterle, F., & Keck, M.
(2017). NMR and MS Methods for Metabolomics. Methods in Molecular Biology,
229–258. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7172-5_13
38. Chen, Y., Li, E. M., & Xu, L. Y. (2022, April 15). Guide to Metabolomics Analysis: A
Bioinformatics Workflow. Metabolites,12(4), 357.
https://doi.org/10.3390/metabo12040357
39. Anwardeen, N. R., Diboun, I., Mokrab, Y., Althani, A. A., & Elrayess, M. A. (2023,
June 15). Statistical methods and resources for biomarker discovery using
metabolomics. BMC Bioinformatics,24(1).
https://doi.org/10.1186/s12859-023-05383-0
40. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., & Raftery, D. (2014). Statistical Analysis and Modeling
of Mass Spectrometry-Based Metabolomics Data. Methods in Molecular Biology,
333–353. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-1258-2_22
41. De Livera, A. M., Olshansky, M., & Speed, T. P. (2013). Statistical Analysis of
Metabolomics Data. Methods in Molecular Biology, 291–307.
https://doi.org/10.1007/978-1-62703-577-4_20
42. MetaboAnalyst. (n.d.). MetaboAnalyst. https://www.metaboanalyst.ca/
59
43. Galal, A., Talal, M., & Moustafa, A. (2022, November 24). Applications of machine
learning in metabolomics: Disease modeling and classification. Frontiers in Genetics,
13. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.1017340
44. Palmer, E. (2019, November 22). Quick Guide to Random Forests. Medium.
https://towardsdatascience.com/quick-guide-to-random-forests-5d2a6b233d1f
45. ICP-OES – ICP Chemistry, ICP-OES Analysis, Strengths and Limitations. (n.d.).
Analysis & Separations From Technology Networks.
http://www.technologynetworks.com/analysis/articles/icp-oes-icp-chemistry-icp-oes-a
nalysis-strengths-and-limitations-342265
60